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第三节 糖化血红蛋白测定
成人的血红蛋白( Hb)通常由HbA ( 97%)、HbA 2( 2.5%)和HbF ( 0.5%)组成。HbA又可分为非糖化血红蛋白，即天然血红蛋白HbA 0( 94%)和糖化血红蛋白HbA 1( 6%)。根据糖化位点和反应参与物的不同，HbA 1可进一步分为HbA 1a、HbA 1b和HbA 1c等亚组分。其中血红蛋白A 1c( hemoglobin A 1c，HbA 1c)占HbA 1的80%，化学结构为具有特定六肽结构的血红蛋白分子。其形成过程是血红蛋白β链N末端缬氨酸与葡萄糖的醛基首先发生快速加成反应形成不稳定的中间产物醛亚胺(西佛氏碱)，继而经过Amadori转位，分子重排缓慢形成稳定不可逆的酮胺化合物，即HbA 1c。HbA 1c浓度相对恒定，故临床常用HbA 1c代表总的糖化血红蛋白水平，能直接反映机体血糖水平，是临床监控糖尿病患者血糖控制水平的较好的检测指标。
糖化血红蛋白( glycated hemoglobin，GHb)测定方法多达60余种，主要分为两大类:①基于电荷差异的检测方法，包括离子交换层析、高效液相色谱分析( HPLC)和电泳法等;②基于结构差异的检测方法，包括亲和层析法和免疫法等。21世纪后，新酶法问世，果糖基缬氨酸氧化酶可作用于糖化的缬氨酸，产生过氧化氢与色原反应，从而测定HbA 1c。临床上多采用免疫比浊法和HPLC法。其中HPLC法，是国际临床化学联合会( IFCC)推荐的测定糖化血红蛋白的参考方法。
一、检测方法
(一) HPLC法 【原理】
用偏酸性的缓冲液处理Bio-Rex70阳离子交换树脂，使之带负电荷，与带正电荷的Hb有亲和力。HbA与HbA 1均带正电荷，但HbA 1的两个β链的N末端正电荷被糖基清除，正电荷较HbA少，造成二者对树脂的附着力不同。用pH 6.7的磷酸盐缓冲液可首先将带正电荷较少、吸附力较弱的HbA 1洗脱下来，用紫外可见分光光度计测定洗脱液中的HbA 1占总Hb的百分数。
HPLC法是基于高效液相层析法原理，使用阳离子交换柱通过与不同带电离子作用来将血红蛋白组分分离。利用3种不同盐浓度所形成的梯度洗脱液使得包括HbA 1c在内的血红蛋白中的多种成分很快被分离成6个部分，并用检测器对分离后的各种血红蛋白组分的吸光度进行检测。分析结束后，以百分率表示各种血红蛋白组分结果。
1.手工检测 【试剂】 ( 1) 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液:
称取无水Na 2HPO 428.396g，溶于蒸馏水并加至1L (即试剂1)。
( 2) 0.2mol/L磷酸二氢钠溶液:
称取NaH 2PO 4· 2H 2O 31.206g，溶于蒸馏水并加至1L (即试剂2)。
( 3)溶血剂:
pH 4.62，取25ml试剂2，加0.2ml Triton X-100，加蒸馏水至100ml。
( 4)洗脱剂Ⅰ(磷酸盐缓冲液，pH 6.7) :
取100ml试剂1，150ml试剂2，于1000ml容量瓶内，加蒸馏水至1L。
( 5)洗脱剂Ⅱ(磷酸盐缓冲液，pH 6.4) :
取300ml试剂1，700ml试剂2，加蒸馏水300ml，混匀即成。
( 6) Bio-Rex70阳离子交换树脂:
200～400目，钠型，分析纯级。
【操作】 ( 1)树脂处理:
称取Bio-Rex70阳离子交换树脂10g，加0.1mol/L NaOH溶液30ml，搅匀，置室温30分钟，其间搅拌2～3次。然后，加浓盐酸数滴，调至pH 6.7，弃去上清液，用约50ml蒸馏水洗1次，用洗脱剂Ⅱ洗2次，再用洗脱剂Ⅰ洗4次即可。
( 2)装柱:
将上述处理过的树脂加洗脱剂Ⅰ，搅匀，用毛细滴管吸取树脂，加入塑料微柱内，使树脂床高度达到30～40mm即可，树脂床填充应均匀，无气泡无断层即可。
( 3)溶血液的制备:
将EDTA抗凝血或毛细管血20μl，加于2ml生理盐水中，摇匀，离心，吸弃上清液，仅留下红细胞，加溶血剂0.3ml，摇匀，置37℃水浴中15分钟，以除去不稳定的HbA 1。
( 4)柱的准备:
将微柱颠倒摇动，使树脂混悬，然后去掉上下盖，将柱插入15mm×150mm的大试管中，让柱内缓冲液完全流出。
( 5)上样:
用微量加样器取100μl溶血液，加于微柱内树脂床上，待溶血液完全进入树脂床后，将柱移入另一支15mm×150mm的空试管中。
( 6)层析洗脱:
取3ml洗脱剂Ⅰ，缓缓加于树脂床上，注意勿冲动树脂，收集流出物，此即为HbA 1(测定管)。
( 7)对照管:
取上述溶血液50μl，加蒸馏水7.5ml，摇匀，此即为总Hb管。
( 8)比色:
用紫外可见分光光度计，波长415nm，比色杯光径10mm，以蒸馏水作空白，测定各管吸光度。
( 9)微柱的清洗和保存:
用过的柱先加洗脱剂Ⅱ3ml，使Hb全部洗下，再用洗脱剂Ⅰ洗3次，每次3ml，最后加洗脱剂Ⅰ3ml，加上下盖，保存备用。
【结果计算】
2.自动化分析仪检测 【试剂】
试剂主要成分参阅手工试剂。各商品试剂组分及浓度存在一定差异。
【操作】
不同实验室具体反应条件会因所使用的仪器和试剂而异，在保证方法可靠的前提下，应按仪器和实际说明书设定测定条件，进行定标品、质控品和样品分析。
【参考区间】
成人糖化血红蛋白:
HbA1( %) 5.0%～8.0%
HbA1c( %) 3.6%～6.0%
3.注意事项 ( 1)环境要求:
层析时环境温度对结果有较大影响，规定的标准温度为22℃，需要严格控制温度。
( 2)标本类型及稳定性:
抗凝剂EDTA和氟化物不影响测定结果，肝素可使结果增高。标本置于室温超过24小时，可使结果增高，于4℃冰箱可稳定5天。
( 3)干扰因素:
溶血性贫血患者由于红细胞寿命短，HbA 1c可降低。HbF、HbH及Hb Bart'S可与HbA 1一起洗脱下来，使结果假阳性;有HbC和HbS的患者，结果可偏低。
(二)亲和层析法 【原理】
用于分离糖化和非糖化Hb的亲和层析凝胶柱，是交联间-氨基苯硼酸的琼脂糖珠。硼酸与结合在Hb分子上葡萄糖的顺位二醇基反应，形成可逆的五环化合物，使样本中的糖化Hb选择性地结合于柱上，而非糖化的Hb则被洗脱。再用山梨醇解离五环化合物以洗脱糖化Hb，在波长415nm处分别测定解析液的吸光度，计算糖化血红蛋白的百分率。
【试剂】
1.洗涤缓冲剂( wash buffer，WB)含250mmol/L醋酸铵，50mmol/L氯化镁，200mg/L叠氮钠，调节至pH 8.0，贮于室温。
2.洗脱缓冲剂( elution buffer，EB)含200mmol/L山梨醇，100mmol/L Tris，200mg/L叠氮钠，调节至pH 8.5，贮于室温。
3.0. 1mol/L及1mol/L盐酸溶液。
【操作】 1.标本
静脉采血，EDTA或肝素抗凝，充分混匀，置4℃可保存1周。
2.溶血液制备
将抗凝全血离心，吸去血浆、白细胞及血小板层。吸100μl压积红细胞至小试管中，加2ml蒸馏水充分混匀，静置5分钟后，重新混匀，离心，上清液应清亮。
3.层析柱准备
层析柱装0.5ml固相凝胶( glyco-gel B)，保存于4℃，防止直射阳光。如凝胶变为紫红色应弃去。测定前取出置室温，拔去顶塞，倾去柱中液体，再除去底帽，将层析柱插入试管中，加2ml洗涤缓冲剂( WB)，让洗涤液自然流出并弃去。当液体水平面在凝胶面上成盘状时即停止。
4.非结合部分( NB)的洗脱
将上述经平衡洗涤过的层析柱插入15mm×150mm标为“NB”的试管中。加50μl清亮的溶血液至盘状液面的顶部，让其流出。加0.5ml WB液，让其流出。此步应确保样品完全进入凝胶。加5ml WB液，让其流出。以上洗脱液总体积为5.55ml，混合。
5.结合或糖化部分( B)的洗脱
将上述层析柱转入标为“B”的试管中。加3ml EB液，让其流出，混匀。
6.比色
紫外可见分光光度计，波长415nm，以蒸馏水调“0”点，分别测定NB及B管的吸光度。
7.层析柱的再生
用过的层析柱应尽快再生。加0.1mol/L HCl 5ml，让其流出并弃去;再加1mol/L HCl 3ml，让其流出并弃去;最后加1mol/L HCl 3ml，塞上顶塞，并盖上层析柱尖端的底帽。在层析柱上标注用过的次数，放置4℃冰箱暗处保存。一般用5次后即弃去。
详细操作应严格按照试剂盒说明书要求。
【结果计算】
【参考区间】
成人糖化血红蛋白: 5.0%～8.0%。
【注意事项】 1.方法学特点
环境温度对本法影响很小。不受异常血红蛋白的影响。不稳定的HbA 1的干扰可以忽略不计。
2.标本类型及稳定性
抗凝剂选择EDTA和肝素均可，于4℃冰箱可保存一周。
(三)免疫比浊法 【原理】
利用TTAB ( tetradecyltrimethylammonium bromide，四癸基三甲铵溴化物)作为溶血剂，用来消除白细胞物质的干扰( TTAB不溶解白细胞)。血液样本不需要去除不稳定HbA 1的预处理，用浊度抑制免疫学方法测定。
先加入抗体缓冲液，样本中的糖化血红蛋白( HbA 1c)和其抗体反应形成可溶性的抗原-抗体复合物，因为在HbA 1c分子上只有一个特异性的HbA 1c抗体结合位点，不能形成凝集反应。然后，加入多聚半抗原缓冲液，多聚半抗原和反应液中过剩的抗HbA 1c抗体结合，生成不溶性的抗体-多聚半抗原复合物，再用比浊法测定。
同时在另一通道测定Hb浓度，溶血液中的血红蛋白转变成具有特征性吸收光谱的血红蛋白衍生物，用重铬酸盐作标准参照物，进行比色测定Hb浓度。
根据Hb含量和HbA 1c含量，计算出HbA 1c的百分比。
【试剂】
1. HbA 1c测定试剂
( 1) R1试剂: 0.025mol/L MES ( 2-morpholino ethanesulfonic acid，2-吗啉乙基磺酸)缓冲液; 0.015mol/L Tris缓冲液( pH 6.2) ; HbA 1c抗体(绵羊血清，≥0.5mg/ml)和稳定剂。
( 2 ) R2试剂: 0.025mol/L MES缓冲液; 0.015mol/L Tris缓冲液( pH 6.2) ; HbA 1c多聚半抗原(≥8μg/ml)和稳定剂。
( 3)标准液:人血和绵羊血制备的溶血液，9g/L TTAB和稳定剂。
2. Hb测定试剂 0.02mol/L磷酸盐缓冲液( pH 7.4)和稳定剂。
3.溶血试剂 9g/L TTAB溶液。
4.质控物 正常值或异常值两种。
5.0. 9% NaCl。
【操作】
1.于小试管中，加溶血试剂1ml，加入人EDTA或肝素抗凝血10μl，轻轻旋涡混匀，避免形成气泡，待溶血液的颜色由红色变为棕绿色后(大约1～2分钟)即可使用。此溶血液于15～25℃可稳定4小时，2～8℃可稳定24小时。
2.根据不同型号生化分析仪及配套试剂设定参数，测定HbA 1c浓度和测定Hb浓度。详细操作程序，必须根据仪器和配套试剂盒的说明书。
【结果计算】
1. IFCC计算方案: 
2. DCCT/NGSP计算方案(糖尿病控制和并发症试验/美国糖化血红蛋白标准化方案) : HbA 1c( %) = 
【参考区间】
成人HbA 1c:
IFCC计算方案: 2.8%～3.8%。
DCCT/NGSP计算方案: 4.8%～6.0%。
【注意事项】
1.定标 当更换试剂批号、更换比色杯和质控结果失控时需要重新定标。
2.不需用溶血试剂预处理。
3.干扰因素 胆红素浓度＜855μmol/L，甘油三酯＜9.12mmol/L，类风湿因子＜750U/ml，抗坏血酸＜2.84mmol/L时对本法无干扰。
(四)酶法 【原理】
用直接酶法测定样本中HbA 1c的百分比，而不需另外检测总血红蛋白，处理后的样本与氧化还原剂反应，去除小分子和高分子干扰物质，变性后的全血样本在蛋白酶作用下分解出氨基酸，其中包括糖化血红蛋白β链上的缬氨酸，糖化的缬氨酸作为果糖缬氨酸氧化酶( FVO)的底物，被特异地清除N-末端缬氨酸，并且产生H 2O 2，在过氧化物酶的作用下氧化色原底物而呈色，进行比色法测定。
【试剂】
试剂主要成分包括: CHES缓冲剂、还原剂、蛋白酶、FVO酶、辣根过氧化物酶、底物等。
【操作】
1. EDTA抗凝全血，2～8℃保存可稳定24～36小时，使用前混匀;将20μl全血与250μl溶血剂混合，避免产生泡沫，室温孵育15～20分钟，其间轻轻混匀几次，当其变为澄清的深红色液体时，证明全血已完全溶解，处理后的样本要于当天检测，室温可稳定4小时。
2.参数如下
温度 37℃
主波长 700nm
反应模式 二点终点法
不同实验室具体反应条件会因所使用的仪器和试剂而异，在保证方法可靠的前提下，应按仪器和试剂说明书设定测定条件，进行定标品、质控样品和样品分析。
【结果计算】
【参考区间】
成人HbA 1c: 3.6%～6.0% (此参考区间引自《临床生物化学检验》第5版)。
【注意事项】
甘油三酯＜7.6mmol/L，总胆红素＜450μmol/L，血红蛋白＜200g/L，葡萄糖＜75.2mol/L时对本法无显著干扰，高HbF (＞10%)可能致测定结果不准确。
二、临床意义
1. HbA 1c与红细胞寿命和平均血糖水平相关，是评价糖尿病患者长期血糖控制较理想的指标，可反映过去2～3个月的平均血糖水平，不受每天血糖波动的影响。
2.与微血管和大血管并发症的发生关系密切。HbA 1c水平升高，糖尿病视网膜病变、肾脏病变、神经病变、心血管事件发生风险均相应增加。
3. HbA 1c对于糖尿病发生有较好的预测能力。
2010年，美国糖尿病协会( ADA)发布的糖尿病诊治指南中正式采纳以HbA 1c≥6.5%作为糖尿病的诊断标准之一。HbA 1c水平在5.7%～6.4%为糖尿病高危人群，预示进展至糖尿病前期阶段，患糖尿病和心血管疾病风险均升高。2011年世界卫生组织( WHO)也推荐HbA 1c≥6.5%作为糖尿病诊断切点。