第三节　类方功效表征与生物学机制研究方法

方剂通过多种功效物质协同互济，融拮抗、补充、整合、调节等多种功效而起到治疗作用，研究表明方剂的疗效取决于其功效物质组与机体生物调控网络间复杂的网状交互作用。因此，方剂功效的客观表征是揭示其生物学机制的前提和保证，构建客观的方剂功效表征体系使其转化为临床医疗的优势所在。通过“病证结合、方证对应、理法方药一致”的研究途径，运用现代科技手段阐明方剂及类方功效的生物学基础，揭示方剂类方功效成分网络与机体生物分子调控网络间的网络关系，诠释中医原创思维的科学内涵。

一、方剂类方功效的生物效应表征适宜方法与技术

（一）基于整体动物模型的类方功效生物学表征方法

1.动物模型

（1）疾病动物模型：

可分为自发性疾病动物模型和诱发性疾病动物模型。前者是指对没有经过任何有意识的人工处理而在自然情况下发生基因突变、染色体畸变的实验动物，通过定向培育而保留下来的疾病模型。例如日本学者发现的原发性高血压大白鼠，是研究人类原发性高血压的理想模型；自发性冠状动脉粥样硬化的老年母猪是研究人类冠心病的理想模型；自发性狗类风湿性关节炎与人类幼年型类风湿性关节炎相似，也是一种理想模型。其他如青光眼兔、无胸腺裸鼠、肥胖症小鼠、自发性真性糖尿病中国地鼠、重症肌无力小鼠等。

与人类疾病完全相同的动物自发性疾病模型并不多，且样本数量受限，因此常需要进行人工诱导。诱发性疾病动物模型是指通过使用物理、化学及生物学等方法，造成动物整体、器官或组织发生一定程度的损害，得到某些类似于人类疾病的动物模型。例如，饲喂四氧嘧啶可得糖尿病（消渴）动物模型。对于一些现代难治疾病，相应的诱发性疾病模型的研究当前较为活跃，如认为灵长类动物其生物学特性、生理、解剖特点与人类相似，是作为人类糖尿病动物模型的最佳选择，并应用链脲佐菌素诱发复制了恒河猴糖尿病动物模型；以双肾双夹肾血管成功获得了大鼠肾性高血压模型。

（2）证候动物模型：

中医证候模型是指在中医药理论指导下，采用生物学等方法使动物出现中医证候的表现。中医证候是疾病发展到某一阶段时对病因、病位、病性及正邪对比情况的病理概括。在诊疗实践中，证候的判断是医生通过综合分析望、闻、问、切四诊收集到的临床资料得出的结论，难免带有主观片面性，因而研究科学的证候动物模型首先需要科学地规范证候的内涵和外延，使证候标准明确、可操作性强且具有较高的可重复性。证候动物模型有别于西医学人类疾病动物模型，是中医药实验方法学有待突破的难点和重点。一般认为，按中医药理论用大黄饲喂小鼠使其出现类似人类的“脾虚证”，然后按中医理论用有健脾功效的方药四君子汤进行治疗，如果病鼠可康复，则把此种小鼠看成人类“脾虚证”的动物模型，但该证候模型尚存一定的缺陷。证候动物模型应在规范的中医证候基础理论的指导下，量化评价指标，从病因、病机入手，复制证候动物模型。如以风、寒、湿为患复制痹证动物模型，以慢性疲劳复制虚证动物模型，膏粱厚味伤脾加大肠埃希菌感染复制温病湿热证动物模型等都是成功的范例。

（3）病证结合动物模型：

病证模型的造模方法一般参照中医的发病学说和西医的致病原理进行复制。如以Ⅱ型胶原免疫所致关节炎动物模型为基础，以风寒湿为痹证外因，肾虚为痹证内因的学说为依据，利用中西医结合肾本质研究的成果，采用复合因子方法制作痹证动物模型。用饮食不节、劳倦过度等因素造成大白鼠脾虚证模型，在此基础上加用氯化铝复制的阿尔茨海默型痴呆疾病模型，补益脾胃方药对其具有较好的疗效。此外，还有采用链脲佐菌素、甲状腺素两种药物复制出Wistar大白鼠肾阴虚型糖尿病动物模型等。

病证结合动物模型的建立采纳了现代科学技术，并依据以古代朴素唯物论和辩证法思想为基础建立起来的中医学理论，再用现代科学的语言表述出来，客观表征证候特点，将病变脏腑器官的生理病理变化进行指标量化，借助生物化学、放射免疫学、红外辐射以及近年来发展起来的信息论、系统论、控制论等进行全面研究，将抽象的中医理论表征为客观的量化指标，更具有准确性、可操作性和可重复性的优势。

2.指标评价体系

建立证候动物模型还应当具有检验模型成功与否的实验数据，即证候实质的物质基础，使模型的复制规范可操作、可重复，促进真正意义上的中医现代化、方剂功效分析和治病的客观化。基于此，段金廒课题组提出方剂功效物质组学（formulae efficacy chemomics）的概念、内容及其方法技术体系。中医功效的效应信息群客观表征主要基于临床信息的功效与临床指标联系的建立以及动物模型的功效与生物活性关系建立，从而发现和优化功效物质组（formulae efficacy chemome）。功效物质组是与某一特定中医功效相关的化学物质的有效组合体。其内涵是研究有效组合体的组成及其相互关系以及与生物体系相互作用的方法学体系。方剂功效物质组是针对一定病证和功效的有效物质组合体，有效关联中医临床功效、生物效应及功效物质的关系。功效物质组及功效物质组学的方法学体系，为符合中医药特点的方剂物质基础研究提供了新的理念和方法技术体系。

王喜军认为以现代医学有限的病理或临床化学指标不足以评价方剂的整体治疗效应。首先，应该建立方剂的整体效应的生物评价体系。方剂的治疗对象是中医的证候及中医的病，只有正确评价证（病），才能评价方剂的效应，进而阐明方剂及相关组成中药的药效物质基础。中医对证（病）的认识是对人体疾病状态的基本描述，它是通过大量的症状信息分析，结合八纲辨证、脏腑辨证等方式进行疾病的诊断或判断。中医证（病）的诊断存在不确定性和模糊性，如何使中医证（病）的诊断实现客观精确和可重现是提高中医药临床疗效的关键及评价方剂效应的前提。从现代系统医学角度来看，中医证（病）是机体对体内外各种环境变化和致病因素作出反应的一种功能状态，其本质是机体失衡而致的代谢或其网络的改变，机体内源性代谢成分的变化通过生物表型的变化而反映出来。而系统生物学的代谢组学技术通过对内源性小分子代谢产物的无歧视分析，通过代谢轮廓、代谢指纹及代谢靶标等途径反映机体受干扰后的代谢网络的变化，反映机体的功能状态。运用代谢组学的手段，阐释证候的生物学本质，构建证候的生物网络，表征证候的生物标志物，可为中医证候的诊断、证候动物模型的建立提供依据。通过方剂与证候的代谢轮廓、代谢指纹及生物标志物等代谢网络的关联研究，建立证候动物模型及方剂的整体效应的生物评价体系。

将方剂的整体效应的生物评价体系与方剂的体内直接作用物质的分析技术相整合，并将两者的分析过程一体化，整合数据，可发现并确认方剂及组成药物的药效物质基础，即利用代谢组学技术阐明中医证候（病）的生物学本质，在证候（病）或证候（病）动物模型基础上分析阐明方剂及相关药物的体内成分，同时分析检测方剂或中药对证候（病）的代谢轮廓及代谢标志物的影响，阐明药物的整体治疗效应，并将证候（病）代谢网络及生物标志物的变化与药物的体内成分的动态相关联，从而阐明药物的药效物质基础。构建基于临床效应的中药药效物质基础的分析体系，使用核心技术——中医方证代谢组学（chinmedomics）技术，即以代谢组学技术阐明证候的生物网络及生物标志物，以桥接证候及相关动物模型，并在此基础上进行方剂的体内成分分析和效应评价，并通过阐明证候的生物网络或代谢标志物的变化与成分体内动态的关系，阐明方剂的药效物质基础。

（二）基于代谢组学的类方功效生物效应表征方法

代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后发展起来的一种研究生物系统的组学方法，其借助现代分析技术、化学计量学和生物信息学技术，通过分析给药前后生物体液中小分子代谢物轮廓的改变，评价或预测药物疗效和毒性。

中医药认识疾病的方法、理论均缺乏适宜的现代科学表征体系，因此，建立沟通中医药与现代医药两种科学体系的桥梁已成为现代生命科学领域的重要命题。系统生物学尤其是代谢组学的崛起与发展为中医药现代化研究提供了契机和挑战，成为沟通中医药与现代医药研究的桥梁。其核心思想在于运用现代分析技术定量地测定生物体在不同状态下（生理病理状态、药物干预前后等）参与物质传递、能量代谢和信息转导等代谢调控的小分子代谢物质即代谢物组的变化，并利用模式识别将这种应答与体内生物学事件相关联，定位事件发生的靶器官，从而确定生物标志物，表征或揭示生物体在特定时间、环境下整体的功能状态。该方法和技术对某生物或细胞所有低相对分子质量代谢产物进行定性和定量分析，在监测活细胞中的化学变化等方面尤其显示出特色和优势，引起了各国科学家的广泛关注，被应用于疾病诊断、药物发现、药效作用机制、药物毒理学等方面的研究。

1.代谢组学对中医证候本质的表征

中医证候是疾病发生和演变过程中某阶段以及患者个体所处特定内、外环境本质的反映，其以相应的症、舌、脉、形、色、神表现出来，能够不同程度地揭示病因、病位、病性、邪正盛衰、病势等病机内容，是诊察和思辨所得。在疾病发生发展过程中，具有各个内在联系的一组症状和体征，可将其称为证候，如风寒表实证具有发热恶寒、头痛、身痛、无汗、脉浮紧、舌苔薄白等症状和体征。每一个证均有其外候与内涵，外候是疾病及其病理的外在表现，是中医通过望、闻、问、切四诊所获得整体信息和诊断、治疗的主要依据，其内涵则是生物体外在表象的背后蕴藏的疾病发生的病因病机、病理变化等生物体内在的变化信息。

生物体受刺激后而发生病理变化的过程中，必然影响其生物代谢网络而产生相应的变化，生物功能状态的最终改变是通过代谢表现出来的，代谢组学对证候模型的评价起到客观化作用，目前已应用于中药对证候模型的影响研究中。刘昌孝等认为代谢组学是从整体的“生化表型”来把握生物体的整体功能状态，传统中医药是从生物体的外在表象及对生物体内在联系的整合归纳，根据由外及内的思想了解生物体的整体功能状态，两者的学术思想具有内在相通性。收集某一证候群的尿液或者血清样本，通过现代分析技术建立相应指纹图谱，对其代谢轮廓分析可获取表征“证候”的客观生物标志物，最终建立其代谢靶点。

基于GC-TOF/MS代谢组学方法，对痰阻心脉型和气阴两虚型冠心病患者血浆中小分子化合物进行全面检测分析。结果发现，两证型间多个内源性代谢物的量存在明显差异，并分析发现与能量、氨基酸和核苷酸代谢异常相关，表明代谢组学方法可区别两证型冠心病，代谢组学的整体数据和标志物信息均显示出痰阻心脉和气阴两虚型冠心病的差异，提示代谢组学研究的体内小分子化合物可能正是中医分型的内在物质基础，为进一步研究探索提供了科学依据。罗和古等通过慢性束缚法建立肝郁脾虚大鼠模型，采用NMR技术分析表明，正常组、模型组代谢产物具有明显差异，涉及能量、脂肪及蛋白质代谢异常，从而提出中医证候是机体对体内、外各种环境变化和致病因素做出的一种功能状态反应，其外象表现为一组有相互关联的症状和体征群，其本质是机体失衡而导致的代谢或其生物网络的改变。

2.代谢组学对方剂整体疗效的表征与作用机制研究

经典的药理学方法结合生物化学和分子生物学技术，通过多靶点相互作用可发现作用靶点和受体。然而，方剂是多成分、多靶点、多代谢途径的复杂体系，单一的药理模型研究方法往往难以全面诠释方剂药味与药味间以及药物与多靶点、多受体之间的相互作用。代谢组学从整体观出发，基于药物治疗对机体状态的改变最终体现在代谢组层面的认识，通过反映代谢网络中多生化途径的整体代谢物谱的差异认识其变化规律，发现药物作用靶点和受体，从而诠释方剂整体性作用机制。王喜军等利用现代多维联用色谱技术，研究不同配伍茵陈蒿汤口服后体内成分及其动态变化规律，阐释了茵陈蒿汤有效成分的体内变化，同时利用代谢组学对整体代谢轮廓的描述，评价中药成分及其代谢产物输入的调整带来整体效应的变化。宿树兰等基于代谢组学探讨了寒凝血瘀原发性痛经（PDM）患者的血浆和尿液整体代谢物谱特征和基因表达差异，发现PDM患者机体代谢、基因表达水平均存在差异，分析鉴定了寒凝血瘀证候PDM患者血浆中19个潜在生物标志物以及尿液中16个潜在生物标志物，发现机体内神经鞘脂类代谢、甾体激素合成以及甘油磷脂代谢发生异常，经少腹逐瘀汤干预后对受到干扰的生物网络具有调节作用，对14个潜在生物标志物（血浆中8个，尿液中6个）具有显著调节作用。刘培等应用代谢组学方法，基于UPLC-QTOF/MS的数据，建立了PCA模型，探讨了气滞血瘀原发性痛经患者的血浆和尿液整体代谢物谱特征，研究结果发现PDM患者机体代谢水平存在差异，并分析鉴定了气滞血瘀证候PDM患者血浆中7个潜在生物标志物，以及尿液中8个潜在生物标志物发现机体内鞘脂类代谢、类固醇激素的合成、甘油磷脂代谢发生异常，经香附四物汤干预后对受到干扰的生物网络具有调节作用，对15个潜在生物标志物具有显著调节作用。Wang等采用代谢组学方法，分析由甲状腺素和利血平联合制备的雄性肾阴虚大鼠体内小分子代谢产物的排泄模式，以及传统中药复方六味地黄丸对其治疗效果。研究结果显示，给予六味地黄丸后，已变化的肾阴虚大鼠的代谢物谱可恢复到基线，显示六味地黄丸的疗效显著。Liang等基于UPLC/TOF-MS代谢组学方法，研究比较人参、丹参以及双龙方对心肌梗死大鼠的治疗干预作用，采用PCA、PLS-DA分析，并经血清生化指标和组织病理学分析证实，双龙方的协同治疗效果优于人参和丹参单味给药。同时，研究还发现双龙方对心肌梗死的治疗作用可能与对心肌能量代谢的调节作用有关。

二、方剂类方生物学机制研究的适宜方法与技术

方剂类方是药物组成上具有相似性的方剂集合，其通过多成分、多途径、多靶点的协同作用发挥了单味药所无法获得的治疗效果，尤其适合于治疗糖尿病、心血管疾病等慢性、复杂、多因素疾病。随着现代生命科学技术的发展，人类对疾病的生物学本质认识不断深化，医药界逐渐认识到多基因、多环境因素及其相互作用引起的复杂性疾病，仅用单一药物难以获得理想的治疗效果，也容易引起较大的毒副作用。长期以来，中药复方化学成分纷繁复杂、组方配伍形式多样及功能主治的不确定性给复方研究带来了巨大挑战，难以用现代科学技术诠释中药复方作用的本质。随着现代科学方法和技术在中医药研究中的引入和应用发展，中药复方的作用机制阐释得到快速进展。

（一）类方效应机制的体内过程研究方法

中药复方是与化学药物迥然有别的复杂生物体系，它作用于目标生物机体时响应的是多维非线性的复杂效应。中药复方体内过程研究有助于揭示中药复方的药效物质基础，确悉药效成分的体内动态规律，明晰体内药效成分与表观药效间的时量与时效间的关联，破译合“诸药之长”以成“有制之师”背后隐藏的配伍规律科学真谛，为打破长久以来困扰中医药“知其然，不知其所以然”的尴尬局面提供了契机。

1.中药复方药动学研究

药物代谢动力学，简称药代动力学或药动学（pharmacokinetics of drug metabolism）是研究机体对药物作用的规律，包括药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄，并运用数学方法，阐明体内药量的动态变化的一门学科。中药复方药动学则应用药代动力学原理研究中药复方在体内的运动过程及动力学规律，它是中药药理学与药代动力学相互结合渗透而形成的。

由于中药复方由多味药组成，每味药又含有多种有效成分，其成分复杂，干扰因素多，所以难度很大，但是意义也十分重大。研究中药复方的药代动力学规律，不仅可以阐明和完善中药复方原理及其作用机制，获取中药复方药动学参数，还能提高中药复方制剂质量、优化给药方案，同时也为在研究中发现新活性代谢产物而创新中药新药奠定科学基础。

多年来，中外学者一直在研究方法学上进行着探索，试图找到一种能更准确、更完整、更科学地揭示中药复方药动学特征的研究方法。国内学者在这方面做了大量的工作，陆续提出了一些假设或设想，如中药证治药动学、中药时辰药动学、中药胃肠药动学、中药血清药理学等。

（1）证治药动学：

1991年，黄熙提出了“证治药动学”假说，该假说又分为辨证药动学和复方效应成分动力学两个概念。前者指药物在不同证者体内药动学参数有明显的差异而这种差异明显能影响药物疗效和毒副反应。而后者指方剂的配伍可以明显改变体内效应成分的药动学参数，并与中药增效、减毒等作用密切相关，可以验证中医“相使、相须”等七情理论是否正确。

朱黎霞等以证治药动学为切入点，以冠心病痰瘀互结证型为研究示例，丹参为模型药物，采用微透析采样技术，探索冠心病大鼠的证治药动学特征，获得了痰瘀互结型冠心病大鼠和正常大鼠体内的丹参素浓度-时间曲线。采用非房室模型处理数据，与正常组相比，高、低剂量下丹参素在冠心病大鼠的达峰浓度增加，但无统计学意义；达峰时间提前，零阶矩（血药浓度时间曲线下面积，AUC）、一阶矩曲线下面积（AUMC）增加，相较于正常组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。研究结果表明，在痰瘀互结型冠心病大鼠模型中，指标成分丹参素生物利用度高于正常大鼠。

（2）时辰药动学：

时辰药代动力学是指不同时间给药可能产生药物不同的吸收、分布、代谢和排泄过程，导致药物体内过程及药代动力学参数等存在着昼夜节律差异。动物实验证明，在昼夜不同时间分别给予实验动物同剂量的药物，其药效、药代动力学、毒性均具有明显差异。不同时间服药可能产生不同的吸收、分布、代谢和排泄过程，导致药物体内过程及药代动力学参数等存在着昼夜节律差异。

夏珂等通过逍遥散对肝损伤大鼠的时辰药动学、时辰药效学研究证明逍遥散对急、慢性肝损伤均具有较好的保护作用。作用机制可能与清除自由基，避免引起脂质过氧化，保护肝细胞膜，使蛋白合成增加，改善代谢混乱，预防肝硬化，促进肝细胞再生等有关，并且疗效与给药时间和剂量密切相关。导致逍遥散昼夜疗效迥异的原因可能是大鼠在病理状态下的昼夜生理节律差异，引起了对逍遥散成分吸收、代谢的影响。

（3）中药胃肠药动学：

中药复方制剂成分复杂，有效成分含量低，药物进入体内后受胃肠道内酸性或碱性、肠道细菌以及自身成分之间相互作用的影响，使这些药物成分的吸收、分布、排泄产生改变，因此造成了其研究的复杂性和不确定性。研究这些作用因素对中药复方制剂药效的影响，阐明中药复方有效成分在胃肠内的药动学变化过程的理论、方法与技术，称为中药胃肠药动学。中药复方制剂在胃肠道内的动态变化是机体对药物的最初始作用，并影响到以后的全过程。因此，通过对中药在胃肠内的代谢研究，有助于发现天然前体药物，揭示中药复方的真正作用成分，对推动药物动力学的研究和发展具有极其重要的意义。

它和中药血清药理学彼此渗透、互相补充，同属于药物体内作用过程研究的范围。现代中药研究已经尝试用中药血清药理学与中药胃肠药动学相结合的思路和方法来研究药物肠内菌代谢及其产物的吸收、分布等过程。

卢兰等建立脾阳虚动物模型，采用附子理中汤干预，以ANP含量及pGC mRNA表达的变化及胃肠肌活动为观察指标，从胃肠运动和水盐代谢平衡角度讨论“脾虚泄泻”的可能机制。结果表明，附子理中汤改善腹泻可能经由ANP-pGC-cGMP信号转导途径，一方面上调ANP的含量及pGC mRNA表达量，进而恢复正常胃肠动力学，另一方面通过对水盐重吸收的调节作用而起效。

（4）血清药理学：

血清药理学是日本学者田代真一在对汉方药研究体系探讨过程中提出的，即指给动物灌服中药，在一定的时间里，取其血清进行实验。血清药理学实验方法是首先给动物服药，定时间采血，分离血清作为药物源进行药理学观察。粗制剂和复杂的成分经过消化吸收、分布、代谢等体内过程，再取含药的血清进行药理实验，比较接近药物体内环境中产生药理作用的真实过程，适用于中药，特别是复方进行药效评价及其作用机制的研究。血清药理学试验方法体外实验条件可控性强，药物效应易于检测，可深入揭示药物作用机制。另外，血清的理化性质与细胞所处的内环境基本相同，所以含药血清能够排除各种干扰使结果真实可靠，能较好地反映中药复方的疗效。同时血清中所含有的效应成分是经过药物在体内的一系列转化、代谢以及由药物作用下产生的内源性应答组成的，因此以血清中的有效成分为指标进行药代动力学研究更能直接、客观地反映中药在体内的药代动力学过程，有利于从细胞水平上探讨中药的作用机制，更好地反映复方配伍的原则和药物量效的关系。

宋珏等采用血清药理学方法，研究黄连、黄芩、黄连解毒汤含药血清对H₂O₂所致PC12细胞氧化应激损伤保护作用的时间-效应关系，结果表明各药的含药血清对细胞氧化损伤都有明显的保护作用，其中以黄连解毒汤作用最强，黄芩和黄芩苷次之，黄连最弱，且对细胞氧化应激模型的保护作用呈时间和剂量依赖性。

2.药动学研究方法

（1）生物效应法：

生物效应法是一种以中药复方的药效为指标进行药动学研究的理论和方法，包括药理效应法、药物累积法和微生物指标法。

1）药理效应法：

20世纪70年代Smolen提出以药理效应为指标测定药动学参数的方法，先建立时效关系和量效关系曲线，换算成血药浓度与时间曲线，据此推算药动学参数。如采用小鼠热板致痛模型，以镇痛效应为指标，测定黄芩苷与清热合剂的药动学参数，发现其口服给药后体内存药量的表观动力学过程符合一室开放模型。此外，还有效量半衰期法和效应半衰期法。药理效应法体现中药复方的整体性，符合中医药的基础理论。但中药复方发挥多方面的作用，仅一种作用并不能代表复方整体的药动学特征。而对同一复方采用不同的药效指标得到的药动学参数可能有较大差异，因此此法的关键是如何选择具有代表性的药效指标，理论上复方的主要作用应与临床适应证一致，且灵敏、可靠、重复性好。

2）药物累积法：

又称毒理效应法，是20世纪80年代初由我国学者赫梅生等提出的以动物急性累积死亡率来估算药动学参数的方法。该法是将血药浓度多点测定与急性死亡率测定蓄积性的方法相结合，以估算药动学参数。实际也是对体内存药量、时间和毒效进行三维转换而测定时效关系。该法具有非特异性，只要能使动物急性致死的药物，不论药物的性质如何，都能求算其药动学参数。主要适用于药理效应和毒理效应为同一组分（单体或有效部分）产生的中药复方。黄衍民等研究乌头注射液在小鼠体内的毒效动力学，发现药物符合一室开放模型。药物累积法也体现中药复方配伍的整体性，符合中医的基本理论。但此法以动物死亡率为指标，体内药动学过程不一定与药效平行，用药剂量也远大于临床实际用量。而且第1次用药可引起组织器官损伤，第2次用药时，这种损伤可能还未恢复至正常，使动物对药物的耐受性降低从而引起药动学参数的变化，因此用该法求得的药动学参数可能与通常情况下药物的实际药动学过程不相符合。

3）微生物指标法：

也称琼脂扩散法，针对具有抗菌活性的中药复方，通过测定体液中抗菌药物的浓度来推算药动学参数。根据抗菌药物在含有试验菌株的琼脂平板中扩散，产生抑菌环，在一定浓度范围内，其抑菌环直径大小与浓度对数呈线性关系，由此可根据回归方程求出未知的样品浓度。该法虽然简单、指标明确、重复性好，但由于中药复方干扰因素多，同时血清有效成分很难达到抑菌浓度，因此该法在中药复方药动学研究中很少用到。

总之，生物效应法在一定程度上体现了中药复方药动学的整体性，符合中医药的整体观。对于有效成分不明确的传统复方具有参考价值，可指导临床用药。但由于药效与血药浓度间常存在滞后效应及生物效应可能受到反馈抑制等因素影响误差大，且目前尚无方法学评价的标准，药动学参数也具有片面性，观测的指标是效应或毒性-时间过程，不是体内药量的经时过程，各项参数反映的是复方的综合疗效和协同效应，因此不能阐明体内有效成分的动态变化。

（2）血药浓度法：

血药浓度法是目前中药复方药动学研究的经典方法，主要适用于有效成分或指标成分明确的中药复方。该法通过测定一种或几种已知成分在体液中的浓度，以中药复方的有效成分血药浓度为指标，使用相关软件计算各种药动学参数，拟合血药浓度-时间曲线，确定药动学模型，以此来反映中药复方药动学规律。此法最早源于1985年日本学者用现代分析手段测定方剂给药后体内药物浓度。五酯胶囊、香附四物汤、滋肾丸等复方均采用此法进行药动学研究。该法通过颈静脉、颈动脉、尾静脉、股动脉、腹主动脉及眼静脉丛等取血方式采集动物给药后的血样，经过液-液萃取、固相萃取或蛋白沉淀法等前处理方式将血浆样本进行处理，利用紫外分光光度法、气相色谱法（GC）、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）、高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-UV）、高效液相色谱-电化学检测法（HPLCECD）、高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）、高效液相色谱-串联质谱联用法（HPLC-MS/MS）等现代分析手段对体内药物浓度进行测定，用WinNonlin 5.2、DAS 2.0等软件计算药动学参数。

虽然现代仪器及分析技术的迅猛发展，特别是HPLC-MS/MS的大力推广，大大提高了生物样品检测的灵敏度和专属性，使得痕量分析甚至直接分析未知的有效成分成为可能，奠定了血药浓度法在中药复方药动学研究中的主导地位，但是此法依然不可避免地存在一定的局限性。对于化学成分复杂的中药复方来讲，用一个或几个指标成分得出的药动学参数可能与复方实际的药动学过程存在一定的偏差，且有效成分的确定，仅是根据单体成分的药效加以判断，并未结合复方整体的药效进行分析。复方的多成分、多靶点之间存在相互作用，缺乏具体方法学的指导，使多成分药动学仍处于起步阶段。

（3）中药复方多效应成分整合药动学：

这一概念是近年由王广基等提出，此研究思路包括确定标志性成分、多组分药动学研究和模型整合。根据AUC自定义各成分血药浓度的权重系数（W_j），运用数学模型进行多组分整合，从整合血药浓度-时间曲线估算整合药动学参数，从而最大限度地呈现中药复方整体药动学行为。随着这一新思路的提出，学者们对多种中药复方进行了整合药动学研究。如张启云等研究复方葛根芩连汤多效应成分分类整合药动学，大鼠灌胃葛根芩连汤后检测11个有效成分的血药浓度，并将这些成分归为黄酮类和生物碱类两类化合物，自定义权重系数，计算葛根芩连汤这两类化合物在大鼠体内综合血药浓度，建立分类整合药动学研究模型，并用统计矩法得到这两类化合物在大鼠体内整合药动学参数，发现分类整合的总黄酮类、总生物碱类的药-时曲线都符合灌胃给药的药物处置规律。也有文献报道了黄连解毒汤在大脑中动脉闭塞（MACO）大鼠体内的多效应成分整合药动学。

中药复方多效应成分整合药动学在一定程度上体现了复方的整体性，使复方药动学研究迈向了一个新的高度。但依然有许多问题悬而未解，如W_j的确定、标志性成分的选择、模型的选择等问题。

（4）中药复方药动学-药效学（PK-PD）结合模型：

基于药理效应法和血药浓度法各自的优缺点，有研究者提出药理效应法和血药浓度法相结合的模型，即PK-PD结合模型，用于研究药物按照时间、浓度和效应三相同步进行的动力学方法。它不仅可以阐明药物在体内动态变化的规律性——临床药物动力学，而且可以揭示药物在效应部位作用的特性——临床药效动力学。将PK-PD结合模型用于中药复方研究，可以阐明和完善其作用机制及复方组方原理，为提高中药复方制剂的质量和优化给药方案提供科学依据，同时也为发现活性代谢产物、开发新药奠定理论基础。目前已有不少文献报道中药复方的PK-PD研究结果：李锐等建立PK-PD模型，探讨四逆汤的药动学与药效学关系，结果表明两者的相关性良好，并指出四逆汤有效部位中乌头类生物碱在整个复方制剂的药效中发挥重要作用，其动力学特征在一定程度上可以反映四逆汤回阳救逆药效的变化。吕莉等报道血塞通注射剂在脑中风患者的PK-PD研究，表明血塞通注射液整合血药浓度与整体药效具有良好的相关性，并提出临床优化给药方案。

尽管中药复方PK-PD研究已取得了一定进展，但PK-PD模型仍然面临许多问题和挑战。基于中药复方具有多成分、多靶点、整体调节的特性，如何寻找和选择合适的药效指标、确定药效物质基础、建立模型等都是复方PK-PD研究的难题。有学者认为可采用多组分化学物质组学、代谢组学、药动学标志物可全面确定中药复方药效物质基础，引入网络药理学理论和方法，综合分析在体效应指标和离体效应指标，并结合中医证候指标进行分析，以建立多靶点的网络生物效应指标体系，利用智能计算方法进行PK-PD相关性分析，建立起中药多组分动态网络靶点效应PK-PD研究模式。向铮等也提出应用代谢组学和复杂网络方法来研究多组分药动学即网络药动学的设想，以期揭示中药复方作用机制。

综上所述，中药复方药动学研究的两种经典方法，即生物效应法和血药浓度法都存在不同程度的缺陷，学者们也一直在探索新的中药复方药动学研究方法，期间涌现出一系列的新型理论假说，从不同层次、不同角度论述中药复方药动学的研究思路和方法，推动复方药动学的发展，如包括“辨证药动学”和“复方效应成分药动学”两部分的“证治药动学”“中药胃肠药动学”“中药血清药理学”。然而上述新理论假说大多数应用某一个或几个药效成分来表明中药复方的药动学特征，并不能完整地刻画整个体系的特征。此后学者们又提出了一些从中药复方整体出发的理论，如复方多效应成分整合药动学、中药指纹药动学、复方药动学-药效学结合模型等，虽然这些思路还存在一定的局限性，在中药复方药动学研究中的应用也较少，但不可否认他们使中药复方药动学研究进入一个崭新的阶段，更能体现中药复方的整体性。

例如，桂枝汤类方出自《伤寒论》，桂枝汤为基本方，由桂枝、芍药、甘草、生姜和大枣组成，具有解肌发表，调和营卫之功效，主治外感风寒表虚证，对体温、血压、肠蠕动和免疫功能等有双向调节作用，现代临床用于治疗感冒等；桂枝加桂汤为桂枝汤中桂枝剂量增加而得，具有温阳祛寒，平冲降逆之功效，是治疗“奔豚证”的方剂，现代临床用于治疗高血压、梅尼埃综合征、充血性心力衰竭等；桂枝加芍药汤为桂枝汤中芍药剂量加倍而得，具有温脾和中，缓急止痛之功效，主治太阳病误下伤中，土虚木乘之腹痛，现代临床用于治疗粘连性肠梗阻、肠易激综合征等。研究采用LC-MS/MS法测定大鼠灌胃给予桂枝汤类方后体内主要成分桂皮酸、马尿酸、芍药苷和甘草次酸血药浓度的经时变化，并比较不同配伍中各成分药动学参数的差异。结果显示，大鼠灌胃给予桂枝汤、桂枝加桂汤和桂枝加芍药汤后血浆中可检测到桂皮酸、马尿酸、芍药苷和甘草次酸。在3个复方组中，桂皮酸均可迅速吸收进入体内，并代谢产生马尿酸，1分钟即可检测到，并随时间呈动态变化，各组中桂皮酸的达峰时间为灌胃给药后的1分钟，血浆中的浓度在6 小时（桂枝汤组）、8 小时（桂枝加桂汤组）和4 小时（桂枝加芍药汤组）后低于最低定量限；马尿酸于灌胃给药后的15～30分钟达峰，血浆中的浓度在24 小时（桂枝汤组及桂枝加桂汤组）和12 小时（桂枝加芍药汤组）后低于最低定量限。各组中芍药苷的达峰时间为15～60分钟，血浆中的浓度在8 小时后低于最低定量限。各组中甘草次酸的达峰时间为6～12 小时，血浆中的浓度在48 小时后低于最低定量限。与桂枝汤和桂枝加芍药汤组比，桂枝加桂汤组桂皮酸的C_max和AUC升高，证明其体内暴露增加，但该影响是由体外的药味用量差异造成的，并非由复方中配伍药物的药动学相互作用引起的。而桂枝加芍药汤组芍药苷的在大鼠体内的C_max的显著升高则是由配伍引起的。

（二）类方效应靶标的系统生物学研究方法

中药复方无论从成分，还是从药效来看都是“整体大于部分之和”，系统生物学从整体上系统研究中药复方的药效物质基础、配伍规律、广泛的药理作用，使中药复方的研究有望建立一个能与中医整体理论相符的研究思路，从分子水平层面阐明方剂作用体系。

1.系统生物学概述

2000年，Leroy Hood教授首次提出了“系统生物学”的概念，即在细胞、组织、器官和生物体整体水平上研究结构和功能各异的生物分子，以及在特定条件下，如遗传、环境因素变化时，分析这些组分间相互关系的学科，并通过计算生物学来定量阐明和预测生物功能、表型和行为。系统生物学研究所有的基因、蛋白质等众多组分间的相互关系，同时通过整合各组分信息，以图画或数学方法建立能描述系统结构和行为的模型。

系统生物学的研究对象是生物体内具有生物学意义和功能的系统。具体来说，系统生物学主要致力于实体系统（如生物个体、器官、组织和细胞）的建模与仿真、生化代谢途径的动态分析、各种信号转导途径的相互作用、基因调控网络以及疾病机制研究等。系统生物学的主要技术平台有基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、相互作用组学和表型组学等，这些高通量的组学实验平台构成了系统生物学的大科学工程。

系统生物学是当前生命复杂体系研究比较公认的科学思维方式和研究手段，它的研究思路与中医学的哲学体系不谋而合，在许多方面有近似的属性。系统生物学在中医“证候”模型的评价和筛选、中药配伍规律研究等方面已有应用。如Sun等对虚证和实证慢性乙型肝炎患者的代谢组学变化进行研究，结果发现5种潜在的可区分虚证和实证的生物标志物。Yang等运用蛋白质组学技术考察了由熟地黄、当归、白芍和川芎4味中药组成的四物汤对于血虚证患者血清蛋白表达谱的影响，结果发现四物汤可能通过增强免疫、增加血红蛋白、减轻基因损伤等途径治疗血虚证。

2.系统生物学研究方法及分析策略

（1）基因组学：

中医药基因组学的预期研究目标是通过基因组学的理论和手段结合传统中医药理论，从基因以及基因与环境的交互影响层次认识中医个体化诊疗的科学内涵，并将中药的药性、功能及主治与其对特定疾病（证候）相关基因表达调控的影响关联起来，在分子水平上用基因组学理论来诠释传统中医辨证论治的科学内涵及中药治疗的作用机制。中医药基因组学包括DNA水平（如全基因组关联分析、DNA甲基化分析等）和RNA水平（如microRNA和mRNA）的研究，其中基因表达谱在中医药研究中已有一定应用。方证相关的基因表达谱研究通过建立不同证型的基因表达谱数据库，发现与特定证候相关的差异表达基因群，对于中医辨证的客观化以及中医证候发展规律的认识具有重要意义。而且进一步通过选择疗效确切、物质基础和作用机制研究相对清楚的中药，利用生物芯片（microarray）等各种高通量技术以及实时荧光PCR等定量分析技术，比较研究中药干预过程中基因表达的差异，编制基因表达谱，经过生物信息学和统计学的比较分析，建立中药治疗过程的基因表达谱数据库，并与中药的化学特征数据库（中药化学物质组学研究）及中医药理论关联，研究中药作用的功能基因表达谱，能够揭示中药作用的信号通路网络。在此基础上结合生物信息学揭示中药不同药效组分（配伍）对基因表达的影响，从功能基因网络层次上诠释传统中医药理论及作用机制。

罗国安课题组以蟾酥为研究对象，通过表达谱芯片筛查大鼠在灌胃蟾酥高、低剂量和麝香保心丸两小时后基因表达差异，通过对差异表达基因进行基因分类和通路富集分析，解释了蟾酥心脏毒性的作用机制及组方成麝香保心丸后的配伍减毒机制。对中药双龙方治疗心肌梗死的药效学评价采用包含6000种基因的整体筛查芯片在整体动物和细胞层次分别进行了研究，建立了正常组、模型组、假手术组、双龙方干预组（高、中、低剂量）以及阳性药物对照组的基因表达谱数据库，通过生物信息学处理发现了180个可能与心肌梗死以及双龙方药物作用相关的表达差异基因，对其中表达差异在8倍以上的10个功能基因，进一步采用荧光定量PCR进行了精确定量，通过基因芯片整体表征和重点基因精确分析，最终获得了双龙方治疗心肌梗死过程所调控的功能基因网络。

（2）转录组学：

转录组即一个活细胞所能转录出来的所有RNA的总和，是研究细胞表型和功能的一个重要手段。转录组学（transcriptomics）是一门在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控规律的方法和技术体系。上一代转录组研究方法包括：基于传统 sangerNIJ序法的 SAGE 技术（serial analysis of gene expression）及 LongSAGE 技术，MPSS（massively parallel signature sequencing）和基于杂交技术的基因芯片技术。其中，基因芯片法必须有相应物种的基因组序列作参照，这给中草药等非模式生物的转录组学研究带来了不便。RNA-seq测序是利用深度测序方法进行转录组分析的二代高通量测序技术。高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，又被称为深度测序（deep sequencing）。目前，大规模平行测序（massive parallel sequencing，MPS）技术平台主要包括 Roche 公司（454 GS FLX）、Illumina 公司（Genome Analyzer Ⅱ）和 ABI公司（AB SOLiD）。

测序过程中的DNA文库制备需要归一化（normalization）。归一化会降低样本中高丰度转录本的数量，从而有利于新基因的发现，但归一化也会消除cDNA样品中基因表达量的差异，研究者需要根据实验目的寻求两者的平衡。另外，在测序的过程中测序深度、覆盖度与测序成本之间也存在微妙的平衡。测序深度是指测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值。假设一个基因组大小为7M，测序总碱基数为70M，则测序深度为10X。覆盖度即测序获得的序列占整个基因组的比例。由于基因组中高GC含量、重复序列等复杂结构的存在，测序最终拼接组装的序列往往无法覆盖所有的区域，这些区域就叫作Gap。测序深度与基因组覆盖度之间是一个正相关的关系，测序带来的错误率或假阳性结果会随着测序深度的提升而下降。当测序深度在10～15X以上时，基因组覆盖度和测序错误率控制才得以保证，即随测序深度的提高，覆盖度会进一步上升，从而有利于后续读段的装配，但测序成本也随之上升。

RNA-Seq原始数据中存在大量的接头序列、polyA/T序列及低质量的读段，这给序列的组装带来严重影响。因此，需对原始数据进行过滤，目前SeqClean、Exonerate、Lucy等软件可完成部分背景序列的过滤。获得转录组测序原始数据后，需要进行序列的从头组装。首先将这些含有overlap的片段连成不含未知核酸序列的组装片段，称之为Contig。再将reads比对回以上得到的Contig，确定哪些Contig有可能来自同一转录本以及Contig之间的距离。再将同一转录本下的Contig连在一起，得到Unigene。再通过聚类分析把Unigene分为两部分，即簇群序列和单一序列（Unigene）。Newbler、CAP3、MIRA、SeqMan和 TGICL等软件配合使用可用于Roche454测序读段的从头组装，使测序读段生成重叠群和单一序列，而SOAPdenovo、Velvet、Trinity和PCAP等软件更适用于更短测序读段的组装。最后将以上所得Unigene序列与蛋白质数据库Swiss-Prot、nr、COG和KEGG做blastx比对分析，选择匹配最好的一项作为注释信息。若是同一序列在不同库的比对结果不同，就要按照nr、Swiss-Prot、KEGG最后COG的比对顺序来确定Unigene序列的最终方向。

我国学者对少数中药复方的转录组也进行了系列研究，例如，李劲平等在基本研究清楚了壮骨止痛胶囊抗绝经后骨质疏松的化学组学基础上，接着研究了全方、有效部位和部分有效成分抗绝经后骨质疏松的基因转录组学。结果表明，绝经后骨质疏松大鼠股骨有532个基因表达发生了变化，全方对于骨质疏松模型大鼠股骨的126个表达发生改变的基因均有不同程度的调节作用，这些基因中已知功能的有45个基因，其余81个基因的功能尚不清楚。将这45个基因根据其功能分为细胞保护基因、能量代谢基因、无机离子代谢基因、信号转导基因、细胞结构基因、基因表达相关基因、免疫相关基因、脂代谢基因、细胞损伤修复基因、胞外基质代谢基因等10个功能类群。与无水乙醇部位比较，石油醚部位主要侧重于对能量代谢基因具有调节作用。与石油醚部位相比，无水乙醇部位主要侧重调节控制基因表达的基因、信号转导基因及胞外基质代谢基因。淫羊藿苷主要对细胞保护基因和能量代谢基因具有调节作用。从转录基因组学分析表明随着化学组学的变化，转录组学随之发生相应的变化，并且壮骨止痛胶囊各化学组分对基因转录组的调节各有侧重。

（3）蛋白质组学：

蛋白质组学有两种研究策略。一种是高通量研究技术，把生物体内所有的蛋白质作为对象进行研究，并建立蛋白质数据库，从大规模、系统性的角度来看待蛋白质组学，更符合蛋白质组学的本质。但是，由于剪切变异和翻译后修饰，蛋白质数量极其庞大，难以实现理想目标。另一种策略是研究不同状态或不同时期细胞或组织蛋白质组成的变化，主要目标是研究有差异蛋白质及其功能，如正常组织与肿瘤组织间的差异蛋白质，寻找肿瘤等疾病标志物并为其诊断治疗提供依据。蛋白质组学研究的支撑技术主要有双向凝胶电泳技术、以质谱为代表的蛋白质鉴定技术和生物信息学技术。完整的蛋白质组学分析包括前期样本的制备和蛋白质的分离，中期的蛋白质的检测及图像分析，蛋白质的鉴定，后期的资料查询及用生物信息学数据库对鉴定结果进行存储、处理、对比和分析等，最终认知机体生化反应的现象与本质。

1）双向电泳技术（two-dimensional polyacrylamidegel electrophoresis，2D-PAGE）：

双向电泳技术凭借其分辨率高、可重复性好、结果直观、实验成本较低等特点，已成为蛋白质组研究中最常用的分离技术。固定化pH梯度技术可以把目的蛋白固定在极狭窄的凝胶区域分离以提高2D-PAGE的重复性与上样量。尽管2D-PAGE分辨率很高，但不能被用于分析低含量蛋白质，即其灵敏度较低，与生物体内蛋白质种类数目相比，远不能满足需要，阻碍了早期状态疾病特异性标志物的发现。

2）生物质谱技术（bio-mass spectrometry）：

质谱技术是蛋白质组学的核心技术。将感兴趣的蛋白质点从凝胶上切下后，进行胶内酶切，将蛋白质降解为多肽片段，通过基质辅助激光解吸电离（matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI）或电喷雾电离（electrospray ionization，ESI）技术使样品分子离子化，根据不同离子间的质荷比（m/z）的差异来分离并确定相对分子质量。在蛋白质组学中，目前最为常用的质谱分析系统包括两大类，即以单一质谱为基础的和以串联质谱为基础的。以单一质谱为基础的质谱分析系统以MALDI-TOF/MS为代表，串联质谱以ESI-MS/MS为代表。

MALDI-TOF/MS是将作为离子源的MALDI和分析检测飞行时间质谱联用。用一定波长的激光打在样品上，使样品离子化，然后在电场力作用下飞行，通过检测离子的飞行时间计算出其质量电荷比，从而得到一系列酶解肽段的分子质量或部分肽序列等数据，最后通过相应的数据库搜索来鉴定蛋白质。该技术精度高、分析时间短，可同时处理许多样品，是高通量鉴定的首选方法，常用于蛋白质的肽指纹图谱（peptide mapping fingerprinting，PMF）鉴定。ESI-MS/MS是在喷射过程中利用电场完成多肽样品的离子化，离子化的肽段转移进入质量分析仪，根据不同离子的质荷比差异分离，并确定分子质量。用此法分析肽混合物、鉴定蛋白质时，可对每一肽段进行序列分析，综合MS数据鉴定蛋白质，大大提高了鉴定的准确度。

在科学研究中可以采用MALDI-TOF-MS测定肽质量指纹图谱（peptide mapping fingerprint，PMF）或运用串联质谱（ESI-MS-MS）测定肽序列，实现对蛋白质的鉴定，其中采用MALDI-TOF-MS测定肽质量指纹图谱是当前蛋白质组研究的常用鉴定方法。

每个蛋白质经过酶解成为长短不一的肽段后，同一时间获得所有肽段分子质量，形成一个肽段分子质量图谱，这个图谱对蛋白质应该是专一的、特异的，因此称为肽质量指纹图谱（PMF）。这一方法不需对图谱进行人工解析，只需将实验获得的PMF与蛋白质数据库中蛋白质的理论PMF比对，就可以鉴定该蛋白质，因此比传统方法速度快、通量高，是用于大规模蛋白质鉴定的质谱方法，也是目前最简便的蛋白质鉴定方法之一。

若蛋白经酶解产生的肽段少于4个，则不能用PMF鉴定蛋白，且有些蛋白用PMF的方法鉴定的结果不可靠，需要进一步得到肽段的序列信息。串联质谱技术可直接测定肽段的氨基酸序列，从一级质谱产生的肽段中选择母离子，进入二级质谱，经惰性气体碰撞后肽段沿肽链断裂，由所得到的各肽段质量数差值推断肽段序列，用于数据库检索，即肽序列标签技术（peptide sequence tag，PST）。

ESI-MS/MS可检测出飞摩尔（fmol）数量级的样品，精确度可达0.005%。质谱还可用于翻译后修饰分析，如磷酸化、糖基化等。

3）生物信息学技术：

生物信息学是在生命科学、计算机科学和应用数学的基础上逐步发展形成的一门新兴交叉学科，是运用数学和计算机手段进行巨量生物信息资源的收集、存储、处理、搜索、利用、共享、分析与解析的科学。蛋白质组学研究任一物种的基因组编码的全套蛋白质，它通常是高通量的，在进行蛋白质功能预测和结构分析时，生物信息学就成为蛋白质组学研究的核心技术之一。

按照处理对象分类，生物信息学中的数据库主要有4种类型：核酸序列数据库、蛋白质序列数据库、蛋白质结构数据库和基因组数据库。根据建库的方式，现有的生物信息数据库也可以大致分为2类：一级数据库和二级数据库。在生物信息学数据库中的一级数据库主要包括了核酸和蛋白质一级结构序列数据库，基因组数据库以及生物大分子（主要为蛋白质）的三维空间结构数据库，通常称为基本数据库，如美国国家生物技术信息中心（NCBI）的GenBank数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）、欧洲生物信息学研究所（EBI）的核酸序列数据库EMBL（http：//www.ebi.ac.uk/embl）和日本信息生物学中心（CIB）的DNA 数据库DDBJ（http：//www.ddbj.nig.ac.uk/embl）等。所谓的二级数据库主要是以一级数据库以及文献资料为基础建立起来的数据库，也称专业数据库。二级数据库有很多种类，例如，基于三维空间结构为基础构建的数据库有蛋白质二级结构构象参数数据库DSSP（http：//swift.cmbi.ru.nl/gv/dssp/），已知空间结构的蛋白质家族数据库FSSP（http：//www.fssp.org/）等。

随着网络技术及计算机技术的发展，蛋白质组学的研究效率也得到极大的提高，蛋白质数据库是代表蛋白质组研究水平的重要标志。蛋白质数据库的类别有以下几种：①按照生物数据信息的存储方式，包括层次型、网状型、关系型以及面向对象型。②按照数据存储种类，包括一级结构序列、三维结构图形、DNA和蛋白质相互作用数据库等。其中，一级结构序列数据库包括 UNIPROT（http：//www.uniprot.org/）、DOMO、SWISS-PROT（http：//www.uniprot.org/）、MIPS（http：//www.helmholtz-muenchen.de/en/mips）等，二维凝胶图像数据库包括WORLD-2DPAGE等，三维结构图形数据库包括SCOP、WSISS-MODEL、CCDC等。③按照数据库内容进行分类，包括蛋白质序列数据库、结构数据库及功能数据库等。其中，序列数据库的功能是作为序列测定，包括PIR（http：//www-nbrf.georgetown.edu/）等，一般是互相结合共同使用。结构数据库包括SCOP等，是对蛋白质间结构关系进行阐述。功能数据库，包括GO数据库（http：//www.geneontology.org/）等，是对蛋白质的功能、细胞组等进行阐述。④专业数据库，是按照实际需求而建立的专业数据库，包括EcoCyc（http：//ecocyc.org/EcoCycUserGuide.shtml）、Wombase 等。

蛋 白 质 序 列 数 据 库 主 要 有 SWISS-PROT、PIR（http：//pir.georgetown.edu/pirwww/）、UniProt、InterPro等，其中最详尽的蛋白质结构数据库为 PDB（Protein Data Bank）（http：//www.pdb.org/pdb/home/home.do）。以蛋白质序列数据库为基础构建的二次数据库有蛋白质功能位点数据库PROSITE（http：//prosite.expasy.org/），蛋白质功能位点序列片段数据库PRINTS（http：//www.bioinf.man.ac.uk/dbbrowser/PRINTS/），同 源 蛋 白 家 族 数 据 库 Pfam（http：//www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/），同源蛋白结构域数据库Blocks。以具有特殊功能的蛋白为基础构建的二次数据库有免疫球蛋白数据库Kabat（http：//immuno.bme.nwu.edu），蛋白激酶数据库PKinase等。蛋白质回环分类数据库则是用于蛋白质结构、功能和分子设计研究的专门数据库。此外，酶数据库 Enzyme Database（http：//www.expasy.ch/enzyme/），限制性核酸内切酶数据库REBASE（http：//rebase.neb.com），辐射杂交、氨基酸特性表、序列分析文献等，也属于二次数据库或专门数据库等。

（4）代谢组学：

完整的代谢组分析流程包括前期生物样品收集、生物样品预处理、中期的样品分析与鉴定、后期的数据分析及标志物生物学意义解读等，最终认知机体生化反应的生命现象与本质。

1）现代分析方法及其技术集成：

完成样本的采集和预处理后，样品中的代谢产物需通过适宜的分离分析技术进行分析与鉴定。随着现代分离分析技术的快速发展，近年来对大量样品和微量代谢物的分析取得了长足进步，为代谢组学研究的具体实施提供了技术支持。目前代谢组学技术平台主要是核磁共振技术（NMR）、质谱（MS）及其联用技术以及多种技术的集成应用。

A.核磁共振（NMR）技术：

NMR技术是最早被用于代谢组学研究的技术之一，目前常用的有氢谱（1H-NMR）、碳谱（13C-NMR）和磷谱（31P-NMR），其中以 1H-NMR 应用最为广泛。NMR技术对样本无破坏性，是现有代谢组学分析技术中唯一能用于活体和原位研究的技术，且几乎无需进行样品前处理。同时NMR技术可对一个样本中所有代谢物进行相同灵敏度无偏向性检测，即能对生物样品进行快速动态检测。基于上述优势，NMR已被广泛地应用于疾病诊断和治疗、药物研发等领域。然而，NMR技术最大的不足在于灵敏度较低，如要对所有代谢产物进行无歧视分析，生物样品中的痕量成分可能会因为被覆盖而检测不到。

针对上述分辨率较低的不足，新发展的高分辨1H-NMR（包括原位活体组织萃取液的高分辨1H-NMR谱、原位活体组织的高分辨魔角旋转1H-NMR谱和生物体液的立体高分辨1H-NMR谱等）大大拓展了代谢组学的实际应用，尤其适用于肿瘤的早期诊断和预后检测。

B.质谱（MS）及其联用技术：

与NMR相比，MS的优势在于灵敏度高、分辨率高及特异性强，但对样品处理的要求较高，因此，需联合色谱技术对样品进行前期分离。根据样本的性质及待检代谢物的不同，通常采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）及毛细管电泳-质谱联用（CE-MS）。GC-MS技术以气体作为流动相，常用于分离分析挥发性化合物，其需要先对样品进行衍生化预处理，故耗时且易引起样品的变化，受此限制，GC-MS技术不能分析热不稳定物质和一些大分子的代谢产物。而LC-MS避免了GC-MS中繁杂的样品前处理，适用于分离分析低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质，能准确定性定量分析各类化合物及其在复杂生物样品基质中含量极低的代谢物类型。现广泛应用的有高效液相-质谱联用（HPLC-MS）和超高效液相色谱-质谱联用（UHPLC-MS），可使分离效率、峰容量及灵敏度进一步提高。CE-MS是根据样品离子在高压直流电场中的迁移速度、电荷及颗粒大小对样品中各组分进行分离；可同时检测多种样品，其所需样品量少，分析速度快，应用范围广。但常用的色谱质谱联用技术都需对样本进行前期处理，而样本经过分离会降低信息通量，甚至导致样品的降解、变质或污染，使检测精度受到影响。

近年来，多种质量分析器，如四极杆（Q）、三重四极杆（QQQ）、飞行时间（TOF）、四极杆飞行时间（Q-TOF）、轨道离子阱（orbitrap），均已频繁地应用到代谢组学研究领域中。质谱学中敞开式电离技术（ambient mass spectrometry）也得到了迅猛发展，其中包括电喷雾解析电离质谱（DESI-MS）、电喷萃取电离质谱（EESI-MS）、实时在线分析质谱（DART-MS）等。敞开式电离技术几乎无需样品预处理，可快速并高通量地对生物复杂基体样品进行定性和定量分析，避免了样品受污染，同时提高了检测的精确度。

C.分析技术集成：

由于各方法技术均有其适用范围和优缺点，同时由于内源性代谢产物的多样性、浓度范围差异较大等复杂性，多采用联用技术和方法整合的策略获得生物体系中尽可能丰富的代谢信息，以客观评价生物标志物的生理学意义。Chen等也利用整合的思想，提出了一套完整的潜在代谢标志物从发现到定性再到生理意义说明的方法。将指纹谱分析、多变量分析、液相-串联质谱（LC-MS/MS）、傅里叶离子回旋共振-质谱（FTICR-MS）、气相-质谱（GC-MS）、数据库检索、同位素标记物比对等方法进行了整合，利用整合后的平台对糖尿病进行代谢组学分析。先用UPLC-MS采集数据，经数据处理后寻找到潜在生物标志物，经过微制备后，再利用FTICR-MS和GC-MS进行分析，得到精确分子量和气相保留指数，再结合碎片分析，通过查询数据库最终确定标志物的组成及结构。通过同位素标记物的比对，最终明确此化合物并进行生理意义的说明。

2）化学计量学分析策略：

代谢组学研究的关键问题并不仅仅在于数据的获取，更在于有效的实验设计和对数据信息的充分解读。然而，由于NMR、GC-MS、LC-MS等所产生的原始谱图复杂、数据量大，采用常规统计分析方法既难以发现样品之间或各组之间代谢组的异同，也难以发现样品中的差异代谢物，因此代谢组学数据需要特殊方法进行数据降维和信息挖掘。可采取监督型（supervised）或非监督型（unsupervised）方法分析数学算法前处理后得到的数据矩阵来发掘蕴涵的有效信息，前者有主成分分析（PCA）、聚类分析（CA）等；后者包括人工神经网络（ANN）、偏最小二乘-判别分析（PLS-DA）等，每一种方法都有各自特点，通过比较、整合可以得到更完整的结果。Crockford等在进行毒理学研究时，采用了多谱学统计（statistical heterospectroscopy，SHY）方法对NMR与MS数据进行了整合，为生物标志物的发现提供了一个系统生物学工具。另外，LC-MS数据和GC-MS数据的融合等也有报道。随着现代自然科学技术不断发展，各种基于整体的研究，如蛋白组学、代谢组学、基因组学等不断出现并相互交叉，通过整合整体研究数据，可以更全面和深刻地阐明生物网络复杂性，准确理解代谢物与蛋白质、代谢物与基因之间的关系。采用代谢组学技术方法结合化学计量学方法探究复杂中医药系统病证物质基础、可能的作用机制以及功效物质基础、分子靶标等，为快速发现中药创新药物提供了基础与可能。

（5）相互作用组学：

后基因组时代面临着巨大的挑战，单个基因产物是如何联合并协同完成复杂的生物过程成为亟待解决的难题。基因组序列决定了蛋白质序列，但这并没能进一步给出蛋白质之间相互作用的信息。蛋白质-蛋白质间的相互作用构成了细胞内外许多重要生命活动的基础，包括抗原-抗体反应、酶的活化和抑制、细胞信号转导和蛋白质的定位等。此外，在不同的组织和细胞中，蛋白质复合物的组成并非一成不变，为适应细胞生长的微环境变化，蛋白质复合物的各组成成分还存在着时间和空间的表达差异性。因此，在组织或细胞中众多蛋白质协同发挥生理作用的过程中，蛋白质复合物的组成分析尤其重要，这也进一步要求我们充分揭示一个细胞或组织中完整的蛋白质-蛋白质相互作用网络——蛋白质相互作用组（interactome）。如何纯化与靶蛋白相互作用的蛋白质成为编织蛋白质相互作用网络的重要一环。为了纯化得到靶蛋白复合物，已陆续出现了酵母双杂交（yeast twohybrid）、免疫共沉淀（Co-Immuno precipitation，Co-IP）、蛋白质芯片（protein chip）和串联亲和纯化（tandom affinity purification，TAP）等技术。

（6）表型组学：

表型组学是近年来发展起来的一门新学科，主要研究生物的物理和化学等表型性状（phenome，表型组）随突变和环境影响而变化的规律，对基因型在不同环境下的全部细胞表型进行系统研究。它在功能基因组学、药物研究和代谢工程领域有潜在的应用价值。表型组学（phenomics）最早由Steven A.Garan于1996年提出，随后在神经科学研究中被研究者使用。2002年，Niculescu和Kelsoe将表型组学用于精神病表型的实验研究中。2006年，Niculescu及其同事提出了一种用于表型组学分析的实验定量方法——Pheno Chipping，并将其与基因组学结合起来，这对于表型组学的发展具有里程碑意义。同时，一些公司和研究机构为了抢占先机和尽快走向商业化应用，投入大量资金和人力用于研究与开发表型组学平台，如比利时CropDesign公司的转基因和植物性状评价的高通量技术平台、英国国家植物表型组学中心、欧洲植物表型组平台（Pheno Fab）、澳洲植物表型组学设施（Australian Plant Phenomics Facility）、南澳大利亚大学的表型组学与生物信息学研究中心（The Phenomics and Bioinformatics Research Centre）以及澳大利亚昆士兰大学的斑马鱼表型组学中心等。表型组学在基因型-表型作图、复杂性状疾病的遗传基础研究、作物改良方面已有广泛的应用。但也面临一些困难，如如何获取不同环境下大样本的基因组信息，广泛而深入的跨时空尺度的表型分析，降低表型组研究的成本等。目前，表型组学在中药复方及类方研究中尚未见应用报道。

（三）类方衍化规律的网络生物学研究方法

1.网络生物学概述

系统生物学的研究表明，细胞的生物功能的产生是基因、mRNA、蛋白及代谢物各个层次内部及层次间不同生命单元在不同水平上相互调节、相互作用的复杂过程。因此，迫切需要新的分析方法以处理生命单元间的复杂相互作用关系，为在整体水平上研究生物网络的结构组成和功能提供了新的技术平台。2004年Barab á si等提出“网络生物学”概念，其主要依赖图论、信息学及最优化方法等来建立网络模型，将复杂生物系统单元（基因、mRNA、蛋白、代谢物）多层次复杂的相互作用形象地表达成网络图，通过分析网络的拓扑特征来获得对生物功能、疾病等生命活动更深入的了解。2005年Cell杂志首次刊登了人类的蛋白质相互作用网络。

Marc Vidal和Dongsup Kim等建立了药物与药物靶点蛋白相互作用网络，拓扑网络特征的分析显示绝大多数药物作用多个靶蛋白，反之亦然，为合理地进行药物发现指明了方向；Barab á si等研究了人类疾病网络（human disease network）及疾病的同病现象（comorbidity），通过整合KEGG、BiGG和OMIM等数据库相关数据，建立了人类疾病网络和代谢疾病网络（metabolic disease network），发现复杂性疾病（如糖尿病）通常与其他的疾病有更多的关联（同病现象显著）；向铮等认为Barab á si的工作在某种程度上解释了“异病同证”和“同人同时患多病”的生物学基础；Ravasz等研究了代谢网络的层次组织特征，发现不同生物类别具有相似的网络特征；Goryanin等认为人类代谢网络（human metabolic network）的构建，对于发现新的药靶和基于系统的药物设计提供了新的策略。上述的研究工作表明网络生物学是复杂生物系统间关系研究的有力工具，为人类认识复杂的生物功能、疾病过程等问题提供了一个全新的解决方案和视角。

通过网络生物学方法构建疾病生物网络（基因调控网络、转录调节网络、蛋白相互作用网络及代谢网络）来获取疾病的生物网络调节、药物靶点信息，为药物作用机制研究提供了新策略。Shipra等应用网络生物学方法筛选了2型糖尿病一个重要的调节通路，并通过实验方法加以确认；哮喘是典型的复杂性疾病，Hwang等构建了哮喘的疾病蛋白相互作用网络，网络分析揭示的疾病通路与文献报道的疾病通路一致，同时还发现了一些潜在的药物靶蛋白如 GNB2L1，BRCA1，为哮喘药物的研发、作用机制研究提供新思路；Chen构建肿瘤细胞凋亡的蛋白-蛋白相互作用网络，发现了3个潜在的药物靶点；Schoeberl等应用网络分析发现在ErbB通路中最佳的肿瘤治疗靶点，这表明网络分析有助于关键通路的识别和优化治疗靶点。我国学者李梢等基于治疗相似性、化学结构相似性及蛋白-蛋白相互作用网络开发了drugCIPHER用于药物靶点的识别；徐筱杰等运用分子对接和网络药理学方法，研究中药所含化学成分和慢性肾病靶标之间的相互作用，快速筛选出中药治疗慢性肾病中的有效成分群及其关键靶标，为中药的研发和作用机制研究提供重要参考。

上述研究表明，网络生物学已广泛用于药物靶点识别、代谢通路的发现和作用机制的研究。罗国安教授认为中药复方作用于人体即是一个“干预系统（中药复方）-应答系统（生物机体）”相互作用整合的生物学过程。

随着疾病生物学研究的深入，人们更清楚地认识到大多数慢性复杂性疾病都与复杂的生物网络系统密切相关，复杂疾病的治疗需要同时调节多个药物靶点。网络生物学方法可构建复杂疾病的生物网络，通过网络拓扑特征分析可以获取疾病生物网络的功能模式（module）、网络模体（motifs）及潜在的药物靶点，从而揭示了中药的作用对象——“生物机体”的生物学特征。中药及其复方通常包括多个有效物质成分，可以同时作用于多个药物靶点，从不同水平调节疾病信号通路以治疗疾病。以网络调节为特点的慢性复杂病证适宜于“多组分、多靶点”的组合干预。因此应用网络生物学的方法来研究“干预系统（中药复方）”“应答系统（生物机体）”的系统内部及系统间关系，最有可能揭示中药复方复杂的药理作用机制。

2.网络生物学研究方法及分析策略

微阵列芯片（microarray）、蛋白质芯片（protein chips）及酶母双杂交筛选系统（yeast two-hybrid screens）等高通量分析技术使人们能够迅速获得细胞、组织、器官或模式生物的基因、蛋白表达以及蛋白质间相互作用数据。目前，生物学和基础医学研究产生的大量科学数据已被整理收录到许多公共数据库中，如NCBI的OMIM 数据库（online mendelian inheritance in man）收集了众多疾病的基因数据；UCLA 的DIP数据库（database of interacting proteins）集中了已验证的蛋白质-蛋白质相互作用数据；DrugBank数据库则提供包括FDA批准的1350个小分子药物在内的近4 800个药物分子及其靶标数据，这些免费或商业数据库为开展网络生物学研究奠定了坚实基础（表3-4）。

网络生物学研究的一般方法如下：

首先，在科学假说的基础上，从大量文献、数据库和实验数据中抽提多种性质要素（基因、蛋白质、药理性质等）；以性质要素为节点，通过计算节点间相互关系，构建性质相互关联网络模型，从而推演各性质要素间潜在的相互联系。这一研究方法融合了生命科学、数学、信息科学、药物化学等相关知识，形成多学科和多层次的生物信息技术平台。

一个典型的网络由许多节点和联接节点的边组成，其中节点表示研究体系中不同的个体，而边用来表示个体间的关系。通常将节点定义为药物分子、靶蛋白或基因等，而节点间的联接反映蛋白质与DNA相互作用关系（转录调控关系）、药物分子与靶蛋白相互作用关系、药物与疾病的相关性或药物分子结构间的相似度等。例如，在Yildirim等构建的药物-靶标网络中，节点是药物分子和靶标，而联接则是DrugBank数据库中描述的药物与靶标间相互关系。生物网络构建方式目前有2种类型：一是利用公共数据库中提供的代谢网络和基因调控网络图等进行修改；另一种是在获取节点间联接强度数据后，采用Cytoscape、Pajek等生物网络绘图软件构建新的网络图。一些常用的相似性度量常被用来计算节点间联接强度，如采用Tanimoto系数来描述药物分子结构的相似性。也有学者提出了一些新的相似性计算方法，如Keiser等提出基于化学结构的靶标相似性算法SEA（similarity ensemble approach），通过配体分子间的结构相似性来描述不同靶点药理作用的相似性。

分析生物网络的目的是尽可能客观准确地找出具有特定生物功能的关键节点和子结构。常用的网络分析算法有：网络节点间最短路径计算、最大节点流量路径搜寻、节点重要性排序等。最初，人们常根据联接数目多少来判定节点的重要程度，但随着对网络结构研究的不断深入，有学者提出了中间态集中度（betweenness centrality）和联接集中度（bridging centrality）等指标来判定关键节点。此外，比较分析也是常用的网络分析方法。它通过对2个或多个网络进行比较，以发现不同生理条件下或不同时间点网络结构的差异，从而找出相对稳定的结构与功能模块。

通过构建假手术组和疾病模型组实验动物表型网络，找出正常组和疾病组表型网络的差异即发生变化的内源性代谢物，然后映射到构建的代谢网络，找寻正常组和疾病组内源性代谢物代谢通路的改变，分析代谢通路中生化反应涉及的酶的变化（突变），然后映射到蛋白-蛋白网络，分析代谢酶涉及的蛋白-蛋白网络及其对蛋白网络的扰动，同时在基因网络中找寻编码代谢酶突变的基因；另一方面，根据相关疾病基因数据库知识，分析疾病基因引起哪些酶的突变，对蛋白-蛋白网络、代谢网络与表型网络的影响。如此自上而下与自下而上相互佐证，相互补充，阐明疾病涉及的生物网络变化过程。

通过构建给药组和对照组表型网络，比较复方给药组与假手术组和模型组网络模型差异，揭示哪些生物网络通路在给药后向正常状态恢复的趋势，并由此映射到代谢网络、蛋白网络和基因网络。

总之，通过系统生物学方法结合药动学-药效学研究筛选复方中药活性组分，在组分与靶点分子对接基础上构建活性组分与靶蛋白相互作用网络，分析比较明确作用机制药物与已知靶点的作用网络与复方中药活性组分-靶点网络的异同，获取复方中药作用机制的进一步信息。揭示复方中药药效物质作用的生物网络途径及协同作用机制。

陈杲等运用网络生物学方法对连花清瘟颗粒/胶囊治疗甲型H1N1流感作用机制进行了分析。首先通过文本挖掘文献证实甲型H1N1流感相关的基因或蛋白质，查询PubChem数据库获得连花清瘟颗粒/胶囊的靶蛋白，依据多个相互作用数据库中数据，分别构建甲型H1N1流感体内反应的蛋白质相互作用网络和连花清瘟颗粒/胶囊的靶蛋白相互作用网络，建立连花清瘟颗粒/胶囊对抗甲型H1N1 流感体的靶蛋白相互作用网络，并进行网络拓扑结构和基因本位论（GO）分析。研究结果表明连花清瘟颗粒/胶囊药理作用主要涉及细胞对外部刺激反应的抑制性调节、细胞凋亡的调节和信号转导等方面，涉及蛋白激酶B（AKT1）、胱天蛋白酶3（CASP3）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、肿瘤基因P53（TP53）、核因子-κBp65（RELA）、核因子 -κBp50（NFKB1）、热休克蛋白 90-alpha（HSP90AA1）等。连花清瘟颗粒 /胶囊可能主要是通过影响AKT1、CASP3等信号通路，调节细胞凋亡而减少病毒复制，抑制甲型H1N1流感的疾病进程。

急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）是急性骨髓性白血病（acute myeloid leukemia，AML）中的一种特殊类型，其恶性程度、短期死亡率和长期缓解率在所有类型的白血病中均为最高。复方黄黛片（Realgar-Indigo naturalis formula，RIF）是由雄黄、青黛、太子参和丹参四味药物组成的复方中药制剂。陈竺、陈赛娟院士领导的课题组用现代生物学的研究手段，揭示了RIF治疗急性早幼粒细胞白血病的多靶点、协同作用机制，首次在分子网络水平上阐明了中药复方治疗机制。为了从网络层面上进一步了解复方黄黛片的治病机制，严诗楷等基于上述文献研究结果，搜索OMIM数据库找出急性早幼粒细胞白血病的致病基因共6个，并将这6个基因编码的蛋白以及文献中RIF所调控的蛋白分别影射到人类蛋白相互作用网络以及KEGG pathway上，构建了这些蛋白的相互作用网络，以及蛋白-信号通路关系网络。这些蛋白之间由于相互作用关系而紧密连接在一起，中药复方RIF或直接作用在APL疾病基因编码蛋白上（如PML-RARa），或作用在与它们有相互作用的蛋白上间接发挥作用而间接作用在其上。RIF作用的这些蛋白同时调控了一系列的癌症相关通路。其中有5个蛋白是AML（acute myeloid leukemia）通路上的蛋白，说明该通路是RIF作用的重点通路。

3.基于网络药理学的类方生物学机制研究方法

网络药理学首次由英国著名药理学家Hopkins于2007年在Nature Biotechnology上提出，是一门基于系统生物学，通过分析生物系统多靶点网络，选取特定信号节点进行多靶点药物分子设计及药理和毒理研究的新学科。疾病发生的分子机制是细胞内调控网络的异常，特别是复杂慢性病往往是由多基因、多功能蛋白相互作用紊乱而形成的疾病网络。网络药理学的突出特点是从系统生物学和生物网络平衡的角度阐释疾病的发生发展过程、从改善或恢复生物网络平衡的整体观角度认识药物与机体的相互作用并指导新药发现。在中药方剂研究中，网络药理学的理论和方法对于理解方剂配伍规律、发现药效物质，阐释中药方剂与证候的关联机制，用于组方用药、方药合用的理性设计等方面具有积极的意义。

网络可视化和网络分析是网络药理学研究的重要工具。网络模型可视化是指使用可视化工具，将联系表反映成一张相互联系的可视网络的过程。在未进行可视化处理前，网络大多非常混乱，难以从中获取明确的信息。网络可视化过程一般分为2个阶段：①丰富网络属性，通过增添网络本身、节点以及连接的属性，使节点联系表扩展为包含丰富信息的网络；②网络描述，通过丰富的特征描述手段，使网络表现更加直观。如使用不同的颜色、形状、大小来表现网络中不同类型的节点和连接。目前主流的网络模型可视化工具包括Cytoscape、GUESS、Pajek等。其中Cytoscape提供多种格式的联系表导入，如txt或者excel格式，支持节点属性和连接属性的导入。

网络分析指采用相应工具对构建得到的网络进行分析，从中提取出有用信息，以便开展后续研究。根据不同的研究目的，网络分析主要可分为以下3类：①网络拓扑学信息计算。网络拓扑学信息计算可以得到网络本身的统计属性，从而反映网络中的隐藏信息。通过计算每个节点的拓扑学属性，可以对节点进行归类排序。②随机网络生成和比较。在网络药理学研究领域中，经常通过生成相同网络属性的随机网络，来对现有网络进行可靠性验证。③网络分层和聚类。网络分层和聚类既是简化网络复杂度的重要算法，也是寻找网络潜在信息的工具。为方便研究，网络分析工具大多和网络可视化集成在同一软件中。如Cytoscape有多种插件或工具包可实现上述3种网络分析功能。

中医理论具有系统观与整体论的思想，虽然与网络药理学的理念不可简单地相提并论，但它们均十分注重在整体条件下开展研究，同时十分重视在致病因素或者药物干预下机体及网络系统的整体反应，而不仅仅是某些局部的病灶或表型改变。同时，方剂是中医防病治病的主要形式，具有多成分、多靶点、多途径的特征，而这些特点与网络药理学理念不谋而合。

（1）网络药理学与中医证候生物学表征研究：

中医学的基本特点在于整体观和辨证论治，以病证结合、方证相应，即病-证-方结合的诊疗模式为特色。阐明证候的生物学基础是中医药现代化的关键之一，因此，随着研究深度和复杂性的增加，需建立适宜于中医证候表征的分析方法。

网络药理学融合“疾病-表型-基因-药物”的信息，从系统的、网络的角度理解疾病表型与生命大分子的关系，其对“疾病表型-生物分子”网络构建的思路适宜于指导中医证候生物学基础研究。有研究者利用网络药理学的方法从生物分子网络角度针对证候的生物学基础展开研究，形成了适用于阐释病证方系统内涵的“表型网络-生物分子网络-药物网络”研究构架，并进一步提出了“证候生物分子网络标志”的构想，构建了基于神经内分泌-免疫（NEI）的寒证、热证生物分子网络，通过网络功能分析，发现寒证生物分子网络以激素的功能模块为主，热证的生物分子网络以细胞因子的功能模块为主，神经递质功能模块共同分布于两个网络。同时，通过网络拓扑结构分析，发现寒热证生物分子网络具有无标度（scale-free）性质，即网络的功能实现主要依赖于一些关键节点，这些关键节点可视作寒证、热证的生物分子网络标志。最后，还分析了证候分子网络标志应用于证候客观化与个体化诊疗、中医药临床效果评价、方剂与中药药性等研究领域的可能性，为证候生物学基础研究提供了一种新思路。

（2）网络药理学与生物学作用机制研究：

方剂的临床疗效是由其组成的各种药效物质之间及其与机体大分子之间相互作用的结果。方剂的多功效成分决定了其作用的多靶点和多环节，不同功效组分对不同环节起作用，最终表现出有利于机体的变化。网络药理学是通过研究多靶点干预疾病网络，揭示药物医学生物学机制。因此，网络药理学的分析思路和方剂/中药复方给药本质殊途同归，网络药理学的方法技术更适宜于方剂作用机制的研究。如徐筱杰等利用网络药理学手段，运用分子对接和复杂网络分析技术研究治疗慢性肾病中药所含化学成分和靶标之间的相互作用。结果显示治疗慢性肾病中药所含化学成分-靶标相互作用网络与西药的化学成分-靶标相互作用网络存在较大的差异，这说明中药的作用机制和西药的作用机制不完全相同。

采用网络药理学方法结合分子相似性分析、化学空间、分子对接、生物网络技术和药代动力学性质预测等计算药理学方法研究了中药精制透骨消痛颗粒中 514 个化合物的作用机制。结果表明该方所含化合物在化学结构上具有多样性而且大部分化合物在化学空间上具有类药性质；通过分析这 514 个化合物与 35 个骨性关节炎疾病相关的公认靶标的相互作用及它们在靶空间的分布，阐明了精制透骨消痛颗粒可能的作用机制，并发现了些潜在的活性分子，揭示多药物、多靶点、多途径分子作用机制。

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