第三节　基于功效物质组学的方剂类方研究思路

方剂功效物质组学是研究有效组合体的组成及其相互关系以及与生物系统相互作用的方法学体系。作为对新的概念和研究方法的探讨，研究者提出了结构性的功效表征-效应信息群-功效物质组-作用机制的研究策略与相应方法技术体系。基于整体观和辨证论治原则有效关联中医临床功效、生物效应及效应物质的关系，建立了功效物质组及功效物质组学的方法学体系，为符合中医临床特点的方剂复杂效应物质基础研究提供了研究思路和方法技术支撑，有助于从功效物质层面深化认识经典方剂及其衍化类方的配伍关系与衍化规律的共性和差异，对中医临床应用具有指导意义，为基于方剂创新药物的发现提供引导。

一、方剂功效物质组学提出的背景与意义

方剂功效是复杂化学物质经多途径的相互作用而表现出来的综合效应。方药配伍效应是其在人体内作用的有次序的整体调节效应。方剂功效物质基础难以归结为某一特定有效成分，其作用机制也难以归结为作用于某一特异性靶点，而是多元效应成分通过多靶点、多环节整合调节作用的结果。成分间、靶点间、环节间组成密切联系、相互协同与制约的复杂关系。

方剂现代研究是揭示临床医家遣药组方发挥功效的时代要求，也是中药新药创制的重要源泉与途径。目前，对于方剂物质基础研究策略与方法主要有以下几方面：杜冠华教授提出的有效成分组学研究策略，罗国安教授提出的化学物质组学及相应的方法体系，梁鑫淼教授提出的本草物质组的设想与建议等，以及中药化学组学、借鉴先导化合物发现和分离单一有效成分开发植物药、方剂优化配伍等研究思路和方法。这些研究有力地推动了方剂现代研究的研究，但这些研究多从实验动物的整体、器官组织、细胞、分子水平获得的有效物质群，缺乏与临床功效的密切关联和对中医基本理论方证相关、病证统一的科学系统阐释。

本课题组在前期已提出以系统论思想和复杂性科学理论为指导，以系统生物学、生物信息学为研究方法和技术支撑的方剂复杂效应物质-生物效应-配伍规律以及方-证-病的研究模式，提出方剂效应物质系统是指由引起方剂特定功效的有效物质构成的系统，是方剂发挥作用的物质基础。以系统生物学研究方法为技术支撑，探求方剂复杂效应物质的科学内涵；运用生物信息学手段分析方-证-病间的相关性，以揭示中医辨证-功效物质-临床疗效间的内在规律。

在深入研究和实践的基础上，本课题组提出方剂功效物质组学（formulae efficacy chemomics）的概念、内容及其方法技术体系。功效物质组（formulae efficacy chemome）是指基于中医药理论和复杂性科学理论，与某一特定中医功效相关的化学物质的有效组合体。其内涵是研究有效组合体的组成及其相互关系以及与生物体系相互作用的方法学体系。方剂功效物质组是针对一定病证和功效的有效物质组合体。同时在四物汤类方、三拗汤类方研究中进行了探索性应用研究，有效关联了中医临床功效、生物效应及功效物质的关系，从而建立了功效物质组及功效物质组学的方法学体系，为符合中医药特点的方剂物质基础研究提供了新的理念和方法技术体系。

二、方剂功效物质组学提出的理论基础

（一）中医药配伍理论是方剂功效物质组学提出的指导思想

方剂是中医临床的主要用药形式，是在中医整体观念和辨证施治原则的指导下，依据药性理论和功能主治，按照君、臣、佐、使的配伍法则，将中药组合而成的有结构、有层次的有机整体，对病证发挥整体调控的治疗效应。功效是中药作用于机体后，对人体的生理功能和病理变化产生不同的调节效应；功效配伍是临床最基本和最重要的配伍理论，依据辨证论治理念，选择合适的药物组成方剂，调整人体功能的偏盛偏衰。

中医方剂的功效物质不单纯是每味中药功效物质的简单相加，因此不能孤立地去研究方剂组方药味，而是从方剂整体性出发进行研究。基于此理论，方剂功效物质组的研究设计就是把方剂作为一个整体进行研究，首先依据方剂的功效特点将方剂的功效进行规范和拆分，结合数据挖掘方法分析，确定不同功效及其特征属性；然后对规范的方剂功效进行效应表征，规范和明确某一功效的特定效应信息群；进一步发现与某一特定效应信息群（功效）相应的物质组以及该物质组与生物体相互作用的关系，最终阐明方剂多元功效的功效物质组群。该方法体系充分体现了方剂对人体的多途径、多靶点整合调节效应，符合中医整体性的作用特点。

在方剂现代研究中引入功效物质组的概念，有利于全面认识中医药配伍理论和方剂复杂的多成分、多靶点作用的治疗模式，摆脱简单化的方剂研究模式，使中医方剂现代研究更符合方剂组方理论和临床功效特点，最终阐明方剂临床疗效的治疗原理。同时，应用现代医学的理论体系阐释方剂治疗作用机制，以促进传统中医药配伍理论的发展。

（二）系统论和复杂性科学是方剂功效物质组学提出的理论基础

方剂配伍体现了系统思想，即方剂的整体性、组方药味的相互联系、方剂配伍的有序性、方剂与机体作用的动态性以及方剂作用的整体性等。因此，方剂配伍构成一个复杂系统，方剂复杂系统与人体复杂系统相互作用，通过多靶点、多环节、多层次地调节疾病过程中的病理生理变化而达到治疗疾病的目的。故现有的基于单一、散在的成分或组分的评价方法，药效与成分相关的研究模式，难以有效地表达方剂内在的病-证-效与功效成分群之间的关联关系，难以反映方剂的多途径、多靶点、多成分综合整体效应。因此，开展基于复杂系统生物学的系统研究已成为发展趋势。“组学”方法和技术与中医药理念相一致，可用于基于整体系统观的方剂功效物质基础研究。

方剂复杂功效物质既具有自身组成结构、内部结构和功能行为的复杂性，又表现出与人体相互作用时功效-物质-效应变化的复杂性。因此，欲阐明方剂复杂功效物质必须在复杂性科学理论指导下进行研究。中医临床用药遵循“有是证，用是方”的基本原则，那么方剂功效物质也应有其相应明确的适应证，从而使方证更加明确、临床疗效更加显著，同时阐明同一方剂对于“同证不同病”治疗的深刻内涵。由此可见，方剂功效物质组的提出与中医用药方-证相应的基本原则相一致。方剂功效物质组的阐明是指导中医临床有效用药的前提，也是方剂由药材饮片配伍到功效物质组配伍的基础。

系统生物学通过整合生物系统中诸多相互作用的组分来研究复杂生物过程的机制，如研究一个生物系统中所有组成成分（基因、mRNA、蛋白质、代谢物、生物小分子等）的构成以及在特定条件下这些组分间的相互关系，并分析这一生物系统在某种或某些因素干预下在一定时间内的动力学过程及其规律。因此，它是一个由下而上的系统组合，即在充分研究基因及生物大小分子结构和功能基础上的一种系统分析和组合。组学技术主要包括基因组（genomics）、蛋白质组（proteomics）和代谢组（metabolomics）等研究技术，它们互补为用，可以从不同的角度和层面研究生物体（包括人体）的生命活动状态，以及外在干预因素作用下的内在机制。

（三）药物相互作用理论是方剂功效物质组学构建的重要支撑

方剂配伍是针对中医病证的整体目标而设，配伍的各组方药味之间通过相互作用、协调补充而发挥整体功效。在方剂配伍关系中，各组方药味融为一体，相互作用、相互影响而对方剂的整体效应产生不同于单味药功效的综合效应，即协同效应、叠加效应和拮抗效应，从而发挥增效减毒的目的，其实质是方剂功效物质之间的相互作用以及与机体间的相互作用。因此，基于药物相互作用理论构建的方剂功效物质组学，不仅对方剂配伍本身的功效物质组的组成、结构、相互关系进行研究，更强调方剂功效物质组进入生物体后各功效成分间的相互作用以及在体内吸收、转运、分布、代谢、排泄、对机体内环境的干扰等环节的影响，客观表征方剂功效物质组及其作用过程。

功效物质组是基于中医药理论和系统生物学方法技术，密切结合中医临床功效与应用特点而提出的新概念和研究体系，旨在全面地解析与某一特定中医功效相关的化学物质的有效组合体的物质组成、结构和功能，构建功效物质库，以及阐述方剂功效物质组的多组分、多环节、多靶点的整合调节效应与机制，从而阐释中医方-证-病关联关系。

三、方剂功效物质组（学）的内涵与外延

（一）方剂功效物质组学的内涵

与生命科学领域的其他组学方法相似，方剂功效物质组学（formulae efficacy chemomics）是研究功效物质组的组成及其相互关系以及与生物系统相互作用的方法学体系。现有的化学物质组学、有效成分组学无疑是中药复杂物质研究的有效手段之一，一定程度上促进了中药复方（方剂）现代研究的深入和发展，但尚缺乏与中医临床功效的密切关联。归根结底，方剂现代研究起源于临床、回归于临床。因此，方剂功效物质组学的提出是基于临床功效，表征临床功效的效应信息群，研究与效应信息群相对应的物质组，从而揭示与功效相关联的物质组的方法学体系。功效物质组是指与某一特定中医功效相关联的化学物质的有效组合体。

方剂功效物质组学的研究是在中医药理论、复杂科学理论的指导下，在系统生物学方法技术支撑下，从整体功效-效应信息群表征-功效物质组优化-网络生物学干预-作用机制阐明，通过有组织、有层次、有结构的系统化、逐步深化的研究策略，阐明方剂功效物质组学的科学内涵。因此，功效物质组的研究可分为4个研究层次，即功效的效应信息群客观表征、与效应信息群相对应的物质组的发现与优化、功效物质组的验证与应用、基于方剂功效物质组的方-证-病关联分析。

（二）方剂功效物质组学的研究层次

方剂功效物质组学研究的主要任务就是在方剂化学成分中寻找与中医功效相对应的物质组，并利用功效物质组进行方剂物质基础与方-证-病关系研究。方剂功效物质组是方剂所有化学成分的一个子集，这些成分整体作用于人体后针对特定病证发挥一定的中医功效。方剂功效物质组中的成分应具有“完备性”，即功效物质组中包含有发挥特定功效所需的全部成分，可能具有不同的结构类型或理化性质及存在形态。此外，还应具有“必要性”，即组中的每一个成分都是发挥该功效所必需的，或者直接作用于机体产生作用或者与其他成分发生相互作用共同产生作用。因此，寻找功效物质组的过程也就是建立中医功效和化学成分间联系的过程。这个过程可以简单地表示为功效-生物活性-物质组三个步骤，这也是寻找功效物质组的基本思路。

1.中医功效的效应信息群客观表征

方剂功效描述是其作用于人体后产生的宏观作用的归纳总结。一方面，一首针对特定病证的方剂通常具有多个相互联系的功效，每个功效的作用部位、强度、特点都有所不同，显然一首方剂应有对应于不同功效的多个功效物质组。另一方面，针对不同病证的方剂很可能有相同文字描述的功效，但各方剂功效的作用特点不同，也应具有不同的功效物质组。因此中医功效应该是一个相互联系的多层次结构，相互间的关系可能有并列、因果、包含等。同时每一个功效还应该具有若干关键属性，如作用部位、强度、适应证型等。不同层次、不同属性的功效即使具有相同的文字描述其功效物质组也不相同，应分别进行研究。如活血化瘀功效，可分为“活血”和“化瘀”两个功效，每个功效还应该具有部位、强度等属性。因此为了找到准确的方剂功效物质组，必须对中医功效表述进行标准化的细分和定位，使其每个描述都具有明确的特征含义。

在准确定位功效后，还需建立中医功效与生物活性或临床指标间的联系。目前，国内方剂研究所采用的临床和药效学标准基本模拟西药药理学，即用多指标体系来解释方剂的药效，与中医功效并无直接联系。建立中医功效与现有指标体系间的关系是寻找功效物质组的必需过程。这个过程可以通过两种方式实现。

（1）基于临床信息的功效与临床指标联系的建立：

中医功效是用来描述方剂作用于人体后产生的综合效果，在临床上筛选具有相似病证的临床患者，全面收集患者的各项化验指标和体征以及服药治疗后的指标变化，在各类病证间进行纵向和横向的比较，以确定与功效相关的指标。举例来说，若某一方剂具有A和B两个功效，作用于患者后引起指标Ea和Eb发生改变，则Ea与Eb应对应于A和B，但还无法确定A与Ea间的对应关系。若另一方剂包含A和C两个功效，会引起Ea和Ec两个指标变化，则两个方剂相比较就可以确定功效A与指标Ea存在对应关系。该方法需要对大量临床数据进行比较分析。

（2）基于动物模型的功效与生物活性关系建立：

相对于临床患者，目前还很难在实验动物上复制出特定的证模型，也就无法确定指标变化。利用中医方证对应的原理，选择经典名方，若作用于动物模型后可引起某指标的显著变化，就可以证明该指标与该方的功效相关。

2.功效物质组的发现与优化

物质组是不同化学成分依据特定比例组成的成分组合，是微观领域上定义的现代科学概念。物质组中的各成分可能已知也可能未知，其结构类型和存在形式也可能多种多样。各成分间应具有一定的逻辑联系，或对人体发挥相互联系的不同作用，或成分间具有特定的相互作用关系。各成分的含量或浓度也应具有一定的范围或比例。

从临床或动物模型上可获得与功效相关的指标体系，但直接用于指引物质组的发现还存在困难，需要根据目前先进的各种组学、系统生物学认识将各指标变化进一步转化为适合成分筛选的组织、细胞或分子水平的生物活性，用于进行物质组发现。

功效物质组是在中医理论和复杂性科学理论指导下提出的，需要针对已知的中医功效、方剂或有效部位的效应、效应物质进行较为深入的研究，进一步管理、交流、共享、总结产生的大量数据，因此建立相关的数据库是必不可少的，这将大幅提高科研效率。

为系统全面地关联活性-化学成分，需尽可能多地对中药方剂中的成分进行定性和定量分析。目前，中药成分的分析方法主要有气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱-质谱联用（GC/MS）、高效液相-质谱联用（LC/MS）等。

3.功效物质组的验证研究

“功效”和“物质组”分属两个不同的领域，无法产生直接的联系，必须通过“生物效应”这一桥梁才能相互联系。一方面，宏观的中医功效在人体上可表现为一系列不同的效应指标；另一方面，物质组中各成分也具有不同的生物效应，物质组作为一个整体也可产生生物效应。因此，生物效应可连接功效和物质组两个宏观和微观概念，是方剂功效物质组中隐含的、不可缺少的组成部分。

对于功效物质组的研究，考虑到研究内容的复杂性，可以根据研究的需要，构建支撑技术平台，按照多层次的研究逐步深入。方剂功效物质组学的主要任务就是寻找方剂中能够代表特定功效的化学成分的组合，也就是功效物质组。其基本思路是首先对中医功效进行细分，然后通过临床资料和实验研究建立特定功效与生物效应间的联系，最后则是以这些生物效应为导向寻找方剂功效物质组。

4.基于方剂功效物质组的方-证-病关联分析

功效物质组强调方-证-病的统一。方剂强调配伍关系，依据各药味的个性之长，发挥“合群之妙用”。其中君药针对主病或主证或主因起主要治疗作用，在方剂组成中不可缺少。臣药协助君药加强治疗作用的药物或针对重要的兼病或兼证起主要治疗作用。佐药配合君、臣药以加强治疗作用或直接治疗次要兼症；或用以消除或减弱君、臣药的毒性，或制约其峻烈之性；或与君药性味相反而又能在治疗中起相成作用。使药则引导方中诸药达到病所或调和方中诸药。因此，方剂功效物质组有其层次和结构，即针对主证证候或主病病理因子的主要功效物质组；针对次（兼）证证候或兼病病理因子的辅助功效物质组。

方剂功效物质组既包含中医功效又包含方剂物质基础，恰好联系了中医理论与实验研究两个方面。利用功效与生物活性间的关系，可发现中医的证、病的治疗特点和内在机制，通过系统生物学研究的辅助，还有助于解释不同病证的生物学机制。功效物质组可以较好地解释方剂对证型和疾病的不同作用效果和关系，更好地解释方剂治疗疾病的机制和内在过程。

四、方剂功效物质组的研究思路与方法体系

方剂功效物质组的技术体系大体上也可分为四部分：中医功效的规范和分类，基于现代系统生物学的中医功效的生物学表征，多指标生物活性为导向的功效物质组的发现和验证，方-证-病关联分析。

（一）中医方剂功效的规范细分

中医功效的规范和细分是寻找功效物质组的前提和基础。但在中医古今论述中这部分内容并不系统完善，还需要专业人员在中医理论的指导下仔细分析不同方剂的功效特点，结合数据挖掘方法分析，最终准确定位不同功效及其特征属性。

1.基于临床和文献资料的中医功效分类和模式识别技术

全面收集关于方剂功效的相关论述，选取有代表性的方剂分析功效特点，借助于现代模式识别技术构建多层次的功效分类模型。依据计算机辅助决策技术筛选特征的功效属性，比较不同方剂功效的相同点和特异点，规范功效的描述，完善每个功效的特征属性值。

基本过程如下：

（1）收集具有相似功效描述的一类方剂，进行初步的用词规范。

（2）根据方剂的主治病证、药物组成、治法治则等信息尽可能丰富功效描述，提出尽可能多的属性特征。

（3）对方剂进行随机分组，借助专家经验，指出任意两张方剂在功效上的相同点和不同点。

（4）调整方剂和专家的随机分组，重复上一步，直至任意两张方剂都采集到足够的异同属性。

（5）对方剂信息进行聚类分析、模式识别及决策树分析，从众多属性中挑选出最恰当的分类属性。

（6）依据关键属性对方剂功效进行分类和细分。

（7）选取其他功效方剂，不断重复以上过程，丰富完善功效的准确定位。

2.基于模型动物的方证功效对应技术

选取与目标功效相关的经典名方，将其应用于不同动物模型上。经过历史验证经典名方已确定可对特定病证产生疗效，反映在动物模型上，若方剂可引起某模型动物指标的显著改善，则这些指标可能与该方剂功效相关。若某方剂对模型动物无作用，则该模型反映的指标变化均不属于该方剂功效。经过多张方剂、多种模型的比较，通过分析方剂和模型指标的异同点就可确定功效与指标间的联系。

（二）中医功效与生物活性的对应

从临床或模型动物上获得的指标大都比较宏观，难以在实验中大量重复以引导功效物质组的发现。利用先进的生物学技术，将指标转化为更高通量的细胞或分子水平，可有效提高筛选速度和精度。

1.基因组学、蛋白组学、代谢组学等生物标志物发现

生物活性指标的变化必然会反映在基因、蛋白、代谢物等分子水平上。利用已知的组学数据库，分析各指标可能对应的靶标或标志物，通过相应组学实验发现特征生物标志物。以生物标志物为关键节点，分别向上游和下游进行扩展，进行分子通路研究。依据通路研究，确定适合于筛选的细胞或分子水平指标。

2.基于网络药理学的通路分析

基于网络药理学的研究成果，从发现的活性指标为起点，在数据库的帮助下在相关网络上逆向分析产生这些指标变化可能的通路，选择通路上的关键节点作为筛选标准。

（三）生物活性导向的功效物质组发现

建立功效与生物活性之间的联系后，应用现代高效筛选技术从方剂化学成分中发现具有特定活性组合的化学成分集合，经过验证后可作为方剂功效物质组。可能包含以下几种子技术：

1.基于数学模型的功效物质组发现技术

中医功效是对方剂作用于人体后产生的各种效应作用的综合体现，其对应的生物活性通常有很多。而方剂中的化学成分更是数量巨大。在多成分、多活性条件下寻找与特定功效相对应的化学成分组合通常都需要数学模型的帮助。

假设某一功效对应的生物活性组合如下式所示：

E=｛e₁，e₂，…，e_i，…，e_n｝

其中E表示中医功效，e_i代表不同的生物活性，该功效与n个生物活性的整体相对应。假设方剂中所有化学成分为C，则有

C=｛c₁，c₂，…，c_j，…，c_m｝

其中c_j 代表不同化学成分种类和含量，共有m种。通常情况下m值都非常巨大。其中不同化学成分又具有各自不同的生物活性，可用以下成分与活性关系矩阵表示：

其中p_ij代表第成分i在活性j上的效应强度。常常情况下P都是一个行数较多的系数矩阵，寻找功效物质组的问题可以归结为求解系数矩阵P，是P中的一个子阵满足预定的功效-活性关系条件。

2.高通量的化学成分分析鉴定和活性筛选技术

寻找功效物质组的过程不仅需要解决大规模化学成分分析鉴定的问题，而且需要高速大通量的生物活性测试。基于以上要求，研究者开发了基于液质联用数据库的中药及天然产物快速鉴定技术，在高效率的UPLC上通过2～3次进样分析自动完成成分鉴定，准确率在90%以上。同时建立高通量高内涵筛选体系，以实现大规模的生物活性筛选。

3.基于定向剔除的功效物质组验证技术

功效物质组中的成分应具有完备性和必要性，即每个成分都有其独特的作用，都必不可少。采用定向剔除技术，有目的地剔除功效物质组中的特定成分，观察剔除成分后的物质组作用于人体或动物模型上是否会取得原有功效。若不能保持原有功效，则证明该成分应是功效物质组中的一部分，不可缺少。反之，则证明该成分不属于功效物质组，既没有独立作用，又不与其他成分发生相互作用。

4.药物相互作用研究

在功效物质组中，必然存在着大量的相互作用关系。研究这些相互作用关系对于分析功效物质组的内在结构具有很大的帮助。由于功效物质组中成分较多，功效所对应的生物活性也比较分散，需要高效率、低重复的实验设计和模型评价方法。研究者基于响应面方法开发了系列相互作用评价方法，所需实验数少，信息量高，可在任意剂量、任意比例下分析协同或拮抗关系，同时给出各自的剂量范围。

5.四物汤类方功效物质组的揭示

本课题组在对四物汤类方研究与实践的基础上，初步揭示了发挥补血功效的功效物质组为36个成分的有效组合，分别源于君药、佐药；发挥活血功效的功效物质组为37个成分的有效组合，分别源于君药、臣药、佐药；发挥调经功效的功效物质组为42个成分的有效组合，分别源于君药、臣药、佐药；发挥止痛功效的功效物质组为42个成分的有效组合，分别源于君药、臣药、佐药。可见，功效物质组的组成同样具有复杂性，其结构层次与方剂配伍结构相一致。例如，研究发现少腹逐瘀汤调经止痛10个功效成分群、活血化瘀16个功效成分群、温经散寒6个功效成分群，其中调经止痛功效成分群可调控MAPK信号通路的关键激酶而发挥其功效（图2-5）。

（四）基于功效物质组的方-证-病关联分析方法体系

方剂功效物质组学的研究本身就包含了方证病间的关系研究。方剂功效可与人体系列效应指标或生物活性相关联，同时方剂功效也对应着特征证型或疾病。根据方证对应的原理，方剂功效恰好是证型或疾病的关键点。同时基于功效物质组，还可将多成分多功效的物质组依据功效不同拆分成相对完整的不同功效物质组。将代表单一功效的物质组给予患者或实验动物，有利于进一步理解证型和疾病的发生发展特点，以多个功效物质组代表方剂作用于患者的证型和疾病，观察证病的各项指标变化，有助于阐明中医方剂的治疗过程及内在机制。

随着人类基因组计划的实施与完成，蛋白组学、代谢组学、基因组学等组学研究相继产生并得到快速发展。各种组学的研究思路和方法不断地被运用到中医药现代化研究中，形成了以复杂科学思路和方法推进中医药现代化的良好趋势。

传统方剂功效复杂多样，化学物质组成极其复杂，依据中医药配伍理论及系统生物学方法技术，将其结构、层次、相互关系及其作用机制等进行阐明，有利于方剂功效及其治疗原理的阐释。功效物质组学可针对方剂的某一特定功效，表征其效应信息群、功效物质组以及与生物体相互作用机制等，从而揭示方剂君臣佐使功效物质组。方剂功效物质组学作为一种创新的组学研究方法，为从传统功效角度出发探索复杂方剂系统的物质基础提供了切实可行的方法学平台，有着广泛的应用前景。功效物质组学不仅对构成方剂的化学物质组进行研究，而且注重与功效相关联，与机体相互作用相一致，因此，符合传统中医整体观和辨证论治的思维方式。

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