第二节　性成熟和促性腺激素对小鼠卵母细胞体外发育能力的影响

一、引言

伴随我国毛纺工业、乳品加工业以及高档餐饮业等产业的高端化发展，高档原材料的供给已成为制约相关产业发展的瓶颈。目前，我国对一些重要经济品种的需求十分迫切，如产毛直径在17μm以下的超细毛羊、产奶量达12t以上的超高产奶牛，以及肉用价值极高的和牛、韩牛等，但这些品种资源均被相关国家视为“国宝”，并作为战略资源加以保护，限制种质资源外流。目前国内已初步建立了相关经济品种的种群，但数量极其有限。由于自然繁殖速度慢，采用人工授精、胚胎移植等常规扩繁技术，建立一个2000只的纯种羊群，至少要10年。利用幼畜卵母细胞体外受精、胚胎移植能够大大缩短世代间隔，尽管性成熟前动物卵母细胞体外成熟、受精后已经产生后代（Revel等，1995；O’Brien等，1997，Khatir等，1998a；Ptak等，1999），但性成熟前动物卵母细胞发育能力差，获得的囊胚移植后获得后代的比例比较低，胎儿死亡的原因不得而知（Seidel等，1971；Pinkert等，1989；Eppig等，1992；Revel等，1995；Damiani等，1996；Khatir等，1996；O’Brien等，1996；Izquierdo等，1999；Wu等，2007）。我们以小鼠为实验模型从细胞和分子水平研究性成熟前后动物卵母细胞体外发育能力问题，并寻找改善卵母细胞发育能力的方法。

（一）卵母细胞的成熟

在讨论卵母细胞发育能力前，先阐述卵母细胞的生成和成熟过程。对于小鼠来讲，卵子生成始于第8天胚胎的原生殖细胞，之后从胚外中胚层迁移到后肠后部内胚层，胚胎生成的第12天，原生殖细胞迁移完全，到达生殖嵴，这时与周围体细胞很快建立密切的关系，发育为卵原细胞。随着一系列有丝分裂过程，大部分卵原细胞分化为初级卵母细胞，并进入第1次减数分裂前期，胚胎生成的第16天，几乎所有的卵母细胞进入粗线期，第18天进入双线期。分娩时，一些卵母细胞进入晚期双线期，双线期的卵母细胞在生长和分化过程中不断地进行物质积累、核定位（Mitra and Schultz，1996）及细胞周期调控蛋白的翻译和翻译后修饰作用（de Vantery等，1996）。在不同动物，卵母细胞在这一时期休止数日至数年不等，出生5天后的小鼠，几乎所有的卵母细胞均处于核网期。很快，这些卵母细胞被一层扁平上皮细胞包围，成为原始卵泡。卵泡不断生长，但卵母细胞仍处于GV期，一直到性成熟前。性成熟后，在体内排卵前促性腺激素峰的作用下开始恢复减数分裂，形成两个一大一小单倍体细胞，经过类似间期的短暂停顿，不进行DNA合成，次级卵母细胞即进入第2次减数分裂。第2次成熟分裂后，由卵泡中释放到输卵管中并接受精子入卵，然后释放第二极体。

卵母细胞成熟涉及到细胞核、细胞质、透明带和卵丘细胞成熟的一个复杂的生理过程，核成熟是处于GV期的初级卵母细胞在MPF等多种因子与激素的作用下重新启动减数分裂，经过GVBD、MⅠ期后，停滞于MⅡ期。细胞质发生的变化包括，RNAs及蛋白质合成，线粒体数量增加，并由近核区移向质膜下区，在一端出现大空泡，即帽状线粒体，卵母细胞的皮质颗粒数量增加，到达MⅡ期时，CGs沿质膜下呈线状排列，核糖体、内质网、营养性包涵物的数量都在增加；缝隙连接数量也增加，通过微绒毛连接与外周卵丘细胞联系，分泌卵丘扩展因子；细胞核的成熟使卵母细胞能够获得减数分裂的能力，细胞质成熟是为卵母细胞激活、原核形成、附植前的胚胎发育做准备。细胞核和细胞质都成熟才能保证正常的受精和胚胎发育。

1.卵母细胞的体外成熟

成年动物每次发情周期，卵巢中约有500～1000个初级卵母细胞在促性腺激素或其他因子的作用下恢复减数分裂，发生生发泡破裂（Germinal Vesicle Breakdown，GVBD），排出第一极体，并发育到第2次减数分裂中期（MⅡ），成为成熟卵母细胞。成熟卵母细胞由极少数优势卵泡发育而成，在卵泡发育过程中绝大部分卵泡闭锁退化，到排卵时只有一个、几个或十几个（猪和犬等）。采用卵母细胞体外成熟技术，开发利用未成熟卵泡，成倍增加雌性动物遗传资源的利用效率，也为其他胚胎工程技术研究和体外生产胚胎提供充足的卵母细胞。

卵母细胞在体内成熟时，卵泡内环境抑制卵母细胞的核成熟，使得核成熟和胞质成熟之间存在最佳平衡，使核质成熟同步化（Nogueira等，2003）；但在体外培养时，卵母细胞离开了卵泡的抑制环境，细胞核成熟的完成并不能保证细胞质的完全成熟。体外成熟卵母细胞获得的胚胎经移植后，其胎儿出生率较体内成熟卵母细胞获得的胎儿出生率低得多，自小腔卵泡中获得的卵母细胞虽然已完成了细胞核成熟，即排出第一极体并发育到MⅡ期，但不能够受精，即使受精后也很难发育到囊胚期；而大腔卵泡中的卵母细胞既能完成细胞核成熟，又能支持胚胎发育到囊胚阶段（Eppig等，1994；Crozet等，1995）。这些现象可能与体外成熟的卵母细胞胞质成熟程度欠佳有关（Eppig等，1998）。近年来，人们应用多种方法改善卵母细胞体外细胞质成熟，包括卵丘细胞共培养（Ge Li等，2008），改善成熟培养液成分，如加入抑制卵母细胞核过早成熟的物质，使核质成熟同步化，加入生长因子、促性腺激素、能量物质，还有能够促进卵母细胞GSH合成的半胱胺酸和胱氨酸等。

2.动物年龄对卵母细胞体外成熟的影响

同一种动物在不同年龄段其卵母细胞体外成熟的情况有所不同。虽然性成熟前动物有腔卵泡卵母细胞能够恢复减数分裂，形成纺锤体，排出第一极体，到达第2次减数分裂中期的比例和成年动物没有差别（O’Brien等，1996；Ledda等，1997；Wu等，2007），但细胞质成熟却存在差异，具体表现在囊胚发育率降低、胚胎移植后胎儿存活率低（O’Brien等，1996；Ledda等，1997；Ptak等，1999）。例如，性成熟前山羊卵母细胞，尽管有高比例的核成熟率（72%），但得到的囊胚率却很低（＜10%），这些都归因于细胞质成熟异常和不完全。有报道表明，性成熟前动物卵母细胞代谢谷氨酸盐和丙酮酸盐速率比成年动物卵母细胞慢，卵母细胞体外成熟过程中mRNA、蛋白质合成、氨基酸吸收、能量代谢、MPF、MAPK活性都比成年动物低，卵丘细胞和卵母细胞之间缝隙连接数量少，卵母细胞周围的卵丘细胞层数也影响卵母细胞成熟（谭景和等，1989）。性成熟前后卵母细胞直径不同，幼年动物卵母细胞直径小；体外成熟后，幼年动物卵母细胞皮质颗粒迁移不完全，多精受精的比例高（O’Brien等，1997；Luderer等，2001），最终导致卵母细胞发育能力差。

（二）影响卵母细胞体外发育的因素

卵母细胞发育能力是指卵母细胞成熟、受精后发育到胚胎特定时期的能力，随着胚胎生物技术在家畜繁育和人类辅助生殖领域的应用，人们对卵母细胞发育能力给予了广泛的关注。本书主要研究卵母细胞经体外受精后发育到早期囊胚的能力。许多报道表明卵泡、卵母细胞大小，卵母细胞的超微结构，卵母细胞周围的卵丘细胞数，卵母细胞所在的卵泡微环境，卵母细胞蛋白和RNA合成，体外成熟培养系统，对卵母细胞发育能力都有影响。因此本书就这些方面研究性成熟前后卵母细胞体外发育能力之间的差别，并寻找改善发育能力的方法。

1.动物年龄对卵母细胞发育能力的影响

初情期是雌性动物初次发情和排卵的时期，是性成熟的初级阶段，是具有繁殖能力的开始。初情期以前，雌性动物的生殖道和卵巢增长缓慢。随着雌性动物年龄的增长逐渐，当达到一定年龄和体重时，即出现第1次发情和排卵。在初情期前，卵巢也有生长卵泡，但后来退化闭锁而消失，新的生长卵泡又再出现，最后又再退化，如此反复进行，直到初情期开始，卵泡才能生长成熟以至排卵。性的成熟是一个过程，概念上与初情期有所不同，但有时两者混用。可以把“性成熟”理解为生殖机能发育的某一特定时期，它是在初情期后的较晚时候，亦即生殖机能达到了比较成熟的阶段。此时生殖器官已发育完全，具备了正常的繁殖能力。但此时身体的生长发育尚未完成，故一般种畜不宜配种，以免影响雌性动物本身和胎儿的生长发育。利用幼畜体外成熟卵母细胞能够最大限度地缩短世代间隔，加速品种改良。然而，性成熟前动物卵母细胞发育能力比成年动物差在多种动物中都得到了证明（cattle：Revel F，1995；Damiani P，M R D，1995；Khatir H，M R D，1996；sheep：O’Brien J K，1996；Ledda S，1997；pig：Pinkert C A，J Reprod Fertil，1989；goat：Izquierdo D，Theriogenology，1999）。但也有一些研究认为和成年动物卵母细胞发育能力没有差别（Armstrong D T，1992；Irvin B，1993）。性成熟前牛和绵羊卵母细胞作为供体已经出生了后代（Revel等，1995；O’Brien等，1997；Khatir等，1998a；Ptak等，1999）。然而，体外成熟的性成熟前牛（Revel等，1995）、山羊（Martino等，1995）、猪（Pinkert等，1989）、绵羊（Ledda等，1997）卵母细胞发育能力都低于成年动物。Eppig and Schroeder（1987）证明，卵母细胞发育能力随着日龄的增加而增强。

2.促性腺激素对卵母细胞发育能力的影响

卵母细胞所在的卵泡环境直接影响体外成熟卵母细胞的发育能力，所以多年来人们一直探索如何操纵卵泡发育以提高卵母细胞的发育能力。在卵泡发育过程中，促性腺激素发挥了关键的作用。所以最常用的方法就是在收集卵母细胞前用促性腺激素处理卵巢，通过调节卵泡发育调节体外成熟卵母细胞的发育能力。然而，促性腺激素对卵母细胞发育能力的影响还存在争议，不同实验室得到的结果不尽相同。激素处理能够提高性成熟前卵母细胞发育能力在多种动物上得到了证明（mouse：Eppig J J等，1994；rat：Zhang等，1989；sheep：Pugh等，1991；cow：Lu等，1991；Grazyna Ptak等，2003），也有一些人认为激素处理没有作用。一些研究认为，激素能提高卵母细胞发育能力（Armstrong等，1991），一些研究认为会降低卵母细胞发育能力（Moor等，1985）。促性腺激素能够引起卵泡颗粒细胞增殖，诱导LHR的合成和类固醇生成酶的表达，调节卵泡内的激素微环境。促性腺激素提高卵母细胞发育能力，是通过产生的一些因子通过细胞-细胞偶联途径导致卵母细胞的生理变化。促性腺激素受体在卵泡细胞中表达，因此，激素作用于卵泡细胞诱导信号，通过缝隙连接传递给卵母细胞，也有人证明激素能够直接作用于卵母细胞，因为在仓鼠的卵母细胞上发现了促性腺激素受体。Wang等（1997）对促排卵和未促排卵的IVM卵母细胞进行比较发现，应用促排卵周期患者的获卵率和达到第2次减数分裂中期（MⅡ期）卵母细胞的数量，明显高于未应用促排卵周期的患者。超排获得的卵母细胞与自然周期获得的卵母细胞在发育能力上存在差异（Bing等，2002）。

注射FSH可以通过抑制颗粒细胞凋亡来挽救自然周期卵巢卵泡发生期间将要发生闭锁的卵泡（Fukushima等，1985；王海滨等，2000）。FSH暂时抑制GVBD，改变第一次成熟分裂所需的时间，促进卵母细胞的成熟。FSH经常与LH协同使用。FSH促进卵丘细胞分泌E2，而E2又可直接作用于卵母细胞（有E2受体）（Fukushima等，1985），调节卵母细胞成熟和钙离子储存。还可能通过提高卵母细胞内在质量直接提高卵母细胞的发育能力。激素处理后SN卵母细胞的比例显著提高。小鼠卵母细胞生长通常在卵泡腔形成时结束，卵母细胞由转录活跃状态转变为转录静止状态，染色质也有弥散，非环绕核仁构型（NSN）转变为致密、环绕型核仁（SN）（Mattioli等，1988）。研究证实，这种转变与卵母细胞获得发育能力密切相关。SN构型卵母细胞的GVBD和成熟至MⅡ期的能力都明显高于NSN型卵母细胞，成熟受精后SN卵母细胞能发育到囊胚，但是NSN型卵母细胞发育则很少能超过2-细胞（Zuelke，1997）。Vandenhyden等（1990）研究表明FSH可以延缓卵母细胞核成熟，使细胞质成熟完全。卵母细胞细胞核与细胞质成熟是相互独立的过程，但是两者需要保持同步才能保证卵母细胞较高的发育能力。

促性腺激素对性成熟前动物卵母细胞发育能力的影响已经有了一些研究。性成熟前动物处理促性腺激素后卵泡得到了生长，改善了卵母细胞发育能力。O’Brien等（1996）的实验表明，注射促性腺激素的4～6月龄的性成熟前小羊，细胞质中线粒体和皮质颗粒的数量增加。Wu等（2007）的研究表明，性成熟前后小鼠卵母细胞发育能力有差别，注射促性腺激素后改善了性成熟前后卵母细胞发育能力，囊胚发育率幼鼠和成年鼠没有差别。Tsafriri等的结果证明，FSH处理的性成熟前后卵母细胞核成熟比例和精子穿透比例没有差别，但是成年山羊卵母细胞比性成熟前山羊卵母细胞的正常受精比例高（49% vs.24%）。然而，这一结论是由于FSH激素引起的还是由于供体年龄引起的未作研究。另外，Ledda等（1997），O’Brien等，（1997）表明注射促性腺激素的性成熟前羊卵母细胞发育能力低于成年羊，而Earl等的结论与之相反，加入促性腺激素处理的山羊颗粒细胞对性成熟前卵母细胞发育能力有促进作用，颗粒细胞作为营养物质产生一些信号，促进卵母细胞细胞质成熟。激素处理的山羊卵泡大，大直径卵泡卵母细胞发育能力好于小卵泡，因此来源于大卵泡的颗粒细胞培养的卵母细胞发育能力好于小卵泡。

另有一些研究认为胚胎早期发育所需的mRNA及蛋白需要卵母细胞积累，由于激素刺激使排卵过早，卵母细胞内mRNA及蛋白水平必然受到影响。超排激素的使用可能导致卵巢过度刺激以及卵母细胞染色体的畸形。人类正常生理周期排出的卵母细胞与超排获得的卵母细胞在基因及蛋白水平上存在差异。另有报道表明，与自然周期的小鼠比较，超排鼠体内囊胚表明微绒毛少，［³⁵S］-蛋氨酸吸收低，细胞数少。

这些研究结论存在一些矛盾可能是因为选择动物的供体年龄、繁殖季节、饲养管理和激素处理方法不同。处理促性腺激素增加了性成熟前动物大的有腔卵泡的数量，增加了卵母细胞的数量，为胚胎体外生产提供了来源。因此，我们需要进一步了解性成熟前动物卵母细胞成熟机制，优化培养条件和促性腺激素的处理方法，提高这些卵母细胞的发育能力。

3.多精子受精对卵母细胞发育能力的影响

卵母细胞受精后，精子细胞核膨大，核膜呈泡状，进而核膜破裂，染色质分散到卵子细胞质中，而且精子的染色质也从致密状态开始松散成为颗粒状或细丝状，随后泡状的核膜在分散的染色质周围集中形成许多小囊，这些小囊相互合并组成一双层结构的核膜，形成雄原核。与此同时，卵母细胞完成第2次减数分裂，染色质首先分散，沿着分散的染色质边缘汇集了一些小囊，它们也逐渐融合形成一双层包膜，从而形成了一些内含染色质的小囊，称为染色质泡。随后这些小泡互相接近，包膜彼此合并形成一个形状不规则的雌原核。雌雄原核逐渐移向卵子的中央，实现融合，染色体彼此聚拢在一起，使配子的单倍体恢复成为合子的双倍体，完成遗传物质的重组。

精子进入卵母细胞后，卵母细胞中形成雄原核生长因子（MPGF），MPGF可能是像核质素（nucleoplasmin）一样的物质，是精核去致密所必需的。维持雌、雄原核形成所必需的物质，其数量是有限的，当精子进入卵中之后，精核和卵核则竞相争夺这种原核形成物质。在小鼠和大鼠，精核比卵原核对原核形成物质具有更大的亲和力，因此，雄原核比雌原核大，但其他动物则不是这样。多精子进入卵母细胞后，同时竞争原核形成物质，使原核直径变小。原核直径和卵母细胞发育能力具有相关性（Payne等，1997），可以用来判定体外受精后胚胎质量及发育潜力。

哺乳动物是单精受精动物，受精时只需一个精子入卵，以保证合子重新恢复二倍体。如果有一个以上精子入卵，通常会导致胚胎发育异常或发育阻滞，最终夭折。影响多精受精的因素包括以下几个方面。

（1）卵母细胞成熟程度　与成熟的卵母细胞相比，未成熟卵由于不能发生完善的皮质反应和透明带反应而呈现较高的多精受精率（Niwa K等，1991；Wang等，1992）。用未成熟卵子受精时，精子的穿入并不能使卵子释放皮质颗粒（CGs）（Wang W H等，1997a；Wang W H等，1997b）。未成熟卵子的多精受精可能与以下几个方面有关：精子穿入未成熟卵子时引起的钙颤不明显，即使直接向卵内注射钙或1，4，5-三磷酸肌醇（IP3）也难以奏效（Machaty等，1997；Mehlmann等，1994）；CGs在质膜下的分布不均匀；未成熟卵中内质网的数目较少（Mehlmann等，1994），内质网是储存钙的细胞器之一；未成熟卵上IP3受体的数目较少，致使卵子对相应激活因子的刺激不敏感（Mehlmann等，1996）。

（2）透明带异常　透明带主要由ZP1、ZP2、ZP3等糖蛋白构成。卵子激活时释放到卵周隙（PVS）的CGs内容物使透明带发生了某些改变，从而阻止了以后精子的穿越（Bauskin等，1999）。多精受精且形成多原核的受精卵，其透明带内层有微细的间断（Keefe等，1997）。

（3）卵泡细胞的作用　卵丘细胞和颗粒细胞上的特有成分能够促进精子获能和发生顶体反应。将卵丘细胞和颗粒细胞在体外培养36h或48h，再将其冻融后加入到IVF液中，可显著地提高精子入卵率，而降低多精受精率（Wang等，1992）。在进行IVF操作时，如果在卵母细胞上保留一定数量的卵丘细胞和放射冠细胞，则可明显提高雄原核（MPN）的形成率。如果在IVM时将卵母细胞与卵泡细胞共培养，则可提高卵母细胞内谷胱甘肽的含量和受精后囊胚发育率（Abeydeera等，1998）。

阻止多精受精的机制主要有两条，一是雌性生殖道的初步筛选，尽管哺乳动物一次射出的精子很多，但能到达受精部位的精子却很少，只有那些活力相当好的精子才能到达受精部位；二是卵子本身所具有的阻止多精受精的能力，卵母细胞的皮质颗粒在阻止多精受精中发挥重要的作用。

皮质颗粒是哺乳动物卵母细胞中的一种圆形的外包界膜的细胞器，许多作者认为来自高尔基复合体，也有作者在小鼠、山羊及牛卵母细胞中发现，皮质颗粒的发生与滑面内质网关系更为密切，其实归根到底都是一个起源，因为高尔基体来自滑面内质网。皮质颗粒直径一般在0.2～0.6μm，内含不同电子致密度的、均质的内容物。原始卵泡中的卵母细胞通常不含皮质颗粒，卵泡开始生长以后，皮质颗粒才开始形成，在不同动物出现的时间不同，在小鼠和大鼠中，由单层卵泡细胞包围的初级卵泡的卵母细胞中就出现皮质颗粒；在牛中，由两层以上卵泡细胞包围的卵母细胞中出现皮质颗粒（谭景和等，1992）；人及兔卵母细胞皮质颗粒在次级卵泡阶段出现（Cran等，1985）。随着卵母细胞的生长，皮质颗粒的数量不断增加。

近年来，人们以荧光素标记的植物凝集素为分子探针、利用激光共聚集显微术研究了一些哺乳动物卵母细胞成熟过程中CGs迁移和重分布情况（Byers等，1992；Yoshida等，1993；Wang等，1997；Carneiro等，2002；Velilla等，2004）。研究结果表明，多数哺乳动物，GV期卵母细胞的CGs分布在整个皮质胞质。卵母细胞不论是在体内成熟还是在体外成熟期间，均发生皮质颗粒向皮质迁移，当卵母细胞完成核成熟、到达MⅡ期时，CGs沿质膜下呈线状排列，有些物种卵母细胞内CGs的分布存在明显的极性，第2次减数分裂纺锤体所在的区域，其质膜下没有CGs，这个区域被称为无CGs区（cortical granules-free domain，CGFD）。在小鼠，CGFD约占整个卵子表面的40%，且该区域常无微绒毛分布（谭景和等，1995）。精子入卵后，激发卵质膜下的皮质颗粒发生胞吐（或称皮质反应），从精子入卵点开始向四周扩散，外排的皮质颗粒内容物中含有蛋白酶或糖苷酶，可溶解透明带ZP₃（糖蛋白）而阻止多余精子与透明带相结合，避免多精受精的发生（谭景和，《脊椎动物比较胚胎学》）。精卵结合时卵母细胞被激活，CGs释放并与质膜融合发生胞吐，引起皮质反应。胞吐到卵周隙的酶类引起透明带糖蛋白结构的改变，阻止了因其他精子再次穿卵而产生的多精入卵，这称为透明带反应。近年来，卵母细胞成熟过程中皮质颗粒迁移及在皮质区的重新分布作为判断卵母细胞胞质成熟的一个指标为越来越多的研究者所接受（Velilla等，2004）。

目前认为，影响卵母细胞成熟过程中CGs迁移和重分布的因素主要有（Liu等，2005）：生发泡破裂（GVBD）是否发生；细胞骨架；卵丘细胞；体外成熟培养液成分。1998年，Connors等用dbcAMP抑制小鼠卵母细胞GVBD的发生，结果CGFD不能形成，说明CGs在皮质区的重分布需要GVBD。对猪（Kim等，1996；Sun等，2001a）和小鼠（Connor等，1998）的研究表明，微丝参与卵母细胞成熟期间CGs迁移和重新分布，在细胞松弛素D（cytochalasin D，CD）处理的卵母细胞中，MⅠ期纺锤体保留在卵母细胞中间，极体不能排出，CGs仍然停留在胞质内部，CGFD没有形成；微管的破坏不影响CGs向皮质区迁移，也不影响CGs重新分布。

许多研究结果表明，性成熟前动物多精受精比例显著高于成年动物，导致体外胚胎发育能力下降，而皮质颗粒在成熟过程中迁移不完全或提前发生胞吐是发生多精受精的重要原因，因此研究性成熟前动物皮质颗粒迁移情况，对于幼年动物卵母细胞发育能力的研究有非常重要的意义。

4.卵泡直径和卵母细胞直径对卵母细胞发育能力的影响

哺乳动物繁殖后代的首要事件就是卵泡发育（Spicer and Echternkamp，1986），即由休眠原始卵泡开始进行生长发育。在性成熟以前，原始卵泡一旦开始生长，大多数卵泡就能够发育到有腔卵泡期，但最终都发生闭锁。性成熟以后，少数卵泡被促性腺激素挽救而继续生长（即周期性募集），经过卵泡选择和优势化以后，一个或数个卵泡发育成熟并排卵（Hirshfield 1991），其他99%以上进入生长群的卵泡发生闭锁（Ireland，1987）。成熟卵泡的大小因物种不同而有所差异，一般牛卵泡达12～19mm、羊卵泡发育至5～8mm、猪卵泡直径8～12mm、马卵泡为25～4mm时即可视为成熟卵泡，此时由于卵泡腔扩大颗粒细胞分裂增殖停止，而使颗粒细胞层变薄仅为2～3层（沈芬霞等，2000）。

卵母细胞发育能力是随着卵泡和卵母细胞生长发育逐渐获得的。在这一过程中，卵母细胞存储RNA和蛋白质，细胞核发生GVBD，染色质凝集，第一极体排出，以及M-II抑制，卵胞质发生细胞器重排、MAPK和MPF活性变化、Ca²⁺释放机制等变化。卵泡直径和卵母细胞直径是衡量卵母细胞质量的一个指标，大卵泡获得的卵母细胞发育能力显著高于小卵泡（Furher等，1989），卵母细胞直径越大，发育能力越强（mouse：Wu等，2007）。有报道表明，22天和26天小鼠卵母细胞发育能力有显著差异，取相同大小的22天和26天小鼠卵母细胞体外受精后，26天小鼠卵母细胞发育能力显著高于22天，这说明卵母细胞获得发育能力是与卵泡发育有关的。26天小鼠卵母细胞随着直径的增加发育能力增加（Eppig等，1992）。卵泡和卵母细胞发育同步化，反映颗粒细胞增殖程度和卵母细胞生长同步化程度和能否用卵泡大小判断卵母细胞发育能力。以前的报道表明猪和绵羊性成熟后卵泡细胞和卵母细胞发育才同步化（Grazyna Ptak等，2006），性成熟前羊卵母细胞和卵泡发育同步化没有成年羊好（0.11vs.0.61）。在成年动物中卵泡直径和卵母细胞直径相关（cattle：Fair等，1995；buffalo：Raghu等，2002），并且和发育能力有关（cattle：Furher等，1989）。观察小牛和成年母牛卵母细胞体外成熟的几项特征，发现小牛卵母细胞的平均直径（118μm±1.15μm）比成年母牛的卵母细胞平均直径（122.83μm±0.74μm）小。牛直径为2～6mm的卵泡为体外培养最佳卵泡，小于2mm卵泡发育能力很低，卵泡卵母细胞的减数分裂能力和胞质成熟能力差；直径大于6mm的卵母细胞其卵裂率及囊胚发育率显著高于直径2～6mm小卵泡卵。Pavlok实验证实，2～8mm之间卵泡卵母细胞有相似率及囊胚发育率，而小于2mm卵泡卵几乎完全缺乏发育至囊胚的能力（Pavlok A等，1992；Lonergan P等，1994）。

5.卵丘细胞对卵母细胞发育能力的影响

卵母细胞的成熟发育与其周围的卵泡细胞的作用是分不开的。卵泡细胞和卵母细胞伸出突起穿过透明带互相联系。在卵母细胞的成熟和受精过程中起着重要作用（Fukui and Sakuma，1980；Fukui and Ono，1989；Zhang等，1995）。卵母细胞在离开卵泡环境后能自发地恢复减数分裂，而细胞核成熟的完成并不能保证细胞质的成熟，1990年Buccione等指出，卵母细胞与卵丘细胞之间的缝隙连接对卵母细胞的生长和减数分裂的维持非常重要，卵丘细胞中的cAMP能促进成熟抑制因子的产生和激活，这些因子转运到卵母细胞，抑制或延迟卵母细胞减数分裂恢复（Eppig and Downs，1984）。

同时，卵母细胞对卵丘细胞的扩展也有调节作用（Buccione等，1990），而卵丘细胞的扩展又影响卵母细胞的成熟。卵丘细胞的扩展，可以使卵丘细胞与卵母细胞间的缝隙连接数量减少或终止，从而导致由卵丘细胞向卵母细胞传递的卵母细胞成熟抑制物质减少或消失，进而引起卵母细胞减数分裂恢复，卵母细胞对卵泡细胞甾类激素的合成和分泌也具有调节作用（Vanderhyden and Tonary，1989）。然而一些作者也证明成熟培养液中加入颗粒细胞对细胞质成熟没有作用。

卵丘细胞参与诱导卵母细胞减数分裂恢复，卵丘细胞在促性腺激素促进卵母细胞减数分裂恢复的过程中起重要作用，可能的机制是，引发颗粒细胞来源的成熟诱导信号，克服卵泡的抑制环境；中断卵丘细胞与卵母细胞之间的缝隙连接。在成熟期间，卵丘卵母细胞之间的偶联发生了动力学上的变化，主要是卵丘细胞内缝隙连接的丢失，它可能是通过中断从外部卵丘细胞到卵母细胞的减数分裂抑制信号的转导来干涉卵母细胞减数分裂的恢复（Eppig and Downs，1987）。

卵丘细胞能够吸引、捕获和选择精子，增加围绕在卵母细胞周围的精子数目；卵丘细胞能够在体外分泌蛋白质，卵丘细胞也可能从输卵管液和卵泡液中或从有血清的成熟培养液中捕获蛋白质提供给卵母细胞。可刺激精子的活力，推动顶体反应，使精子对透明带反应（Zona reaction）敏感，形成顶体反应诱导配体，精子穿过卵丘基质纤维网时，可以去掉其表面覆盖物。另外一些功能包括，卵丘细胞产生的孕酮能够促进精子发生卵质膜反应；促进延长卵的寿命，减缓排卵后ZP的硬化，淘汰运动能力不强的精子。在卵成熟过程中，卵母细胞分泌旁分泌因子，与FSH协同作用，可以促使卵丘细胞分泌透明质酸，从而促进卵丘扩展，有利于精子穿入卵丘。

卵母细胞和卵泡细胞相互作用是一个双向的过程，卵泡环境决定卵母细胞发育能力，卵母细胞的旁分泌因子对卵泡的发育也有重要作用，在没有卵母细胞的情况下，卵泡不能生长和发育，卵母细胞对卵泡细胞发育的调节方面的研究始于将兔的卵母细胞去掉，卵泡细胞就发生黄体化。卵母细胞分泌的因子调节卵泡细胞的功能，包括卵丘细胞黏液化和透明质酸的产生（Buccione等，1990）；细胞增殖，类固醇生成和抑制素的合成；urokinasetype plasminogen activator（uPA），促黄体激素受体的生成（LHR），and kit-ligand（KL）。卵母细胞分泌因子TGFβ包括TGFβ1、GDF-9和BMP-15，能够模拟卵母细胞对卵泡细胞的作用，GDF-9、BMP-15缺乏的小鼠和绵羊卵泡发育不正常。

6.卵母细胞胞质中GSH对卵母细胞发育能力的影响

谷胱甘肽是一种巯基三肽，全称为γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸，是在哺乳动物机体中广泛分布的一种主要的非蛋白巯基复合物，体细胞和配子中均有存在。谷胱甘肽以两种形态存在，即还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG），但在哺乳动物细胞中，约90%以上的GSH以还原型存在。在谷胱甘肽过氧化物酶类和谷胱甘肽还原酶类的作用下，GSH和GSSG发生相互转化，同时与过氧化氢或其他有机氧化物反应，从而起到解毒的作用。转化分子式如下。

（1）卵母细胞胞质中GSH的合成　在细胞中，半胱氨酸和谷氨酸在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的作用下生成γ-谷氨酰半胱氨酸，其中半胱氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶分别是GSH合成的限速底物和限速酶。γ-谷氨酰半胱氨酸再与甘氨酸在GSH合成酶的作用下进一步生成GSH（图1-1）。

在许多低等有机体γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（GCL）是单独的多肽，大多数真核生物GCL酶是异二聚体复合物（包括两个不同基因的产物），催化亚基较大（GCLC 637 amino acids，approximately 73kDu），包含ATP依赖的结合半胱氨酸的氨基和谷氨酸的羧基的活性位点。调节亚基较小（GCLM 274 amino acids，approximately 31 kDu），通过直接与GCLC作用增加GCLC的催化效率。GCLM降低谷氨酸和ATP的K_m，增加GSH反馈抑制的K_i（Meister等，1983）。GSH竞争性地抑制GCL，通过和谷氨酸竞争GCLC的活性位点，GCLC有低的催化活性，催化半胱氨酸和谷氨酸结合形成γ-谷氨酰半胱氨酸，调节亚基没有催化活性，但能与催化亚基结合，调节催化亚基的催化效率（Huang等，1993）。GCLM通过降低GSH的反馈抑制调节酶的活性（Huang等，1993），正常生理条件下，GSH的合成受两个因素影响——半胱氨酸的利用和GCL活性，细胞培养液中半胱氨酸迅速氧化成胱氨酸，进入细胞后，迅速被还原为半胱氨酸。有报道表明，添加BSO（抑制GCL活性）能显著降低谷胱甘肽的合成，增加了颗粒细胞凋亡和卵母细胞碎裂。正常生理条件下，GCLC没有催化活性，和Gclm结合才起作用。调节GCL的两个亚基基因表达，能够调节细胞内GSH的合成。在卵巢中健康卵泡Gclm表达水平高，而闭锁卵泡Gclm表达量低，排卵前促性腺激素刺激使得膜细胞Gclm显著增加，促性腺素处理后GCLC和Gclm水平增加，GCL酶活性增加，使得卵巢GSH合成显著增加（Luderer等，2001）。

（2）GSH在卵母细胞成熟、受精及早期胚胎发育过程中的作用　细胞内谷胱甘肽的合成是卵母细胞胞质成熟过程中的一个重要部分。许多学者认为卵母细胞体外成熟后GSH的含量是卵母细胞胞质成熟的有效标示之一（Abeydeera等，1998；de Matos等，1997；de Matos等，2000）。可见，GSH在卵母细胞成熟过程中发挥着重要的作用。

①使细胞免受自由基和代谢产生的氧化型中间产物（如过氧化物）的氧化损伤（Meister等，1983）。

a. GSH作为辅酶，通过调节氧化还原反应，调节蛋白和DNA合成。GSH能够保护纺锤体免受氧化损伤，以维持减数分裂纺锤体正常的形态和功能，确保正常的合子形成。

b. GSH能够维持配子细胞膜的稳定。细胞外的GSH能够清除培养液等细胞外环境中的ROS，从而抑制配子细胞膜上的脂质过氧化反应，防止细胞外物质对配子的损伤（Brad等，2003）。

c. GSH保护蛋白质免受氧化损伤。GSH能够与配子细胞内蛋白质结合成混合的二硫化物（蛋白质-S-S-谷胱甘肽），从而起到保护蛋白质的作用（Bernard等，1995）。

②GSH参与精子染色体解凝、卵母细胞激活、雄原核形成等过程。GSH参与仓鼠（Perreault等，1988）、猪（Yoshida等，1993）和牛等动物的受精和雄原核形成。GSH提供启动雄原核形成之前染色质解凝聚所需的还原基团。精子染色体解凝是雄原核形成的第一步，而精子染色体的解凝需要精子染色体中的二硫键的还原来诱导。GSH是精子内重要的巯基，是二硫键还原的重要影响因素。

③GSH参与氨基酸的转运，促进蛋白质的合成。Meister首先提出了γ-谷氨酰循环，解释了谷胱甘肽在氨基酸跨膜转运中的机制，见图1-2。

④GSH参与卵母细胞受精和早期胚胎发育过程。在许多哺乳动物中，卵母细胞成熟过程中合成GSH，在小鼠（Calvin等，1986）、仓鼠、猪（Yoshida等，1992）、牛（de Matos等，1996；de Matos and Furnus，2000）和羊（de Matos等，2002）.中都有报道。卵母细胞在卵巢内发育成熟过程中，卵母细胞内GSH的浓度会随着排卵的临近而持续升高，卵母细胞成熟期间GSH的积累将会改善卵母细胞的胞质成熟质量、保护卵母细胞在受精后的胚胎发育阶段免于受到氧化损伤（de Matos等，2000）。卵母细胞受精后，GSH浓度显著下降，这表明GSH参与了卵母细胞的受精过程，主要是参与受精后雄原核形成过程（de Matos等，2002）。已经有报道指出，向猪、牛卵母细胞体外成熟培养液中添加能够促进GSH合成的物质将会提高卵母细胞发育到囊胚的能力（De Matos and Furnus，2000）。卵母细胞在含有新生牛血清（newborn calf seum，NBCS）、PVA（polyvinyl alcohol，PVA）、半胱氨酸和表皮生长因子的成熟液中成熟后，卵母细胞的成熟率高于仅仅添加PVA组卵母细胞的成熟率。在猪卵母细胞体外培养液中增加半胱氨酸和表皮生长因子可以提高卵母细胞的成熟率及显微受精（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）胚的卵裂率，这可能也是由于增加GSH的浓度的缘故。研究表明，在生理条件下，成熟的小鼠和仓鼠卵母细胞中高的GSH浓度是受精后形成雄性原核和促进早期胚胎发育的基础。GSH水平标志着哺乳动物胚胎质量和发育能力。成熟MⅡ（metap haseⅡ stage，MⅡ）期卵母细胞中GSH的含量最高。一般来说，MⅡ卵母细胞中GSH浓度是生发泡破裂时卵母细胞的2倍。如用人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadot ropin，HCG）诱导仓鼠排卵，卵母细胞中GSH浓度在随卵母细胞的发育而增加，从GV阶段的1.0pmol/Oocyte到MⅠ阶段期的1.62pmol/Oocyte，最后增加到MⅡ阶段的2.0pmol/oocyte。然而，在受精合子和胚胎发育的早期，GSH水平下降非常快。在仓鼠胚胎植入前到囊胚阶段，GSH的浓度还达不到MⅡ卵母细胞中GSH浓度的10%。已排卵的卵母细胞中相对高的GSH浓度可以作为胚胎发育到孵植前抗氧化的潜在储库。

半胱胺能够提高半胱氨酸吸收，增加GSH合成所需的底物（Meister等，1983）。体外成熟培养液中添加半胱胺能改善雄原核的形成，在山羊（Rodriguez-Gonzalez等，2003）、水牛和猪上都有研究。缺乏半胱胺对雄原核形成有影响在猪和牛上也有报道。半胱胺增强精子去凝集在体外成熟的仓鼠卵母细胞上都有报道。GSH能促进雄原核形成物质的形成。

（3）半胱胺和胱氨酸在促进卵母细胞GSH合成作用　在卵母细胞中，低分子质量的巯基化合物催化合成谷胱甘肽，这些巯基化合物的有效成分为含硫氨基酸，如半胱氨酸和胱氨酸、半胱胺或β-巯基乙醇。巯基化合物诱导GSH合成提高合子中GSH的浓度，促进胚胎发育到囊胚阶段。大量的证据证明，GSH是在γ-谷氨酸循环中合成，而且它的合成依赖于氨基酸前体（如半胱氨酸）的获得。另一方面，胱氨酸可能是被卵丘细胞转变为半胱氨酸，然后参与GSH的合成。此外，其他低分子巯基化合物（如半胱胺、β-巯基乙醇）能够还原胱氨酸为半胱氨酸。

半胱胺作为重要的巯基物质，目前关于它的研究主要集中在应用其改善卵母细胞成熟质量方面。现在已经证明牛、猪、水牛、山羊、绵羊和成鼠等在卵母细胞体外成熟过程中添加半胱胺能促进细胞内GSH合成，帮助穿卵精子解聚和雄原核形成，进而提高胚胎发育水平。TCM199中的半胱氨酸含量很低（0.6μM）且十分不稳定，易被氧化成为胱氨酸（Sagara等，1993），这样就可能会使GSH合成受阻。TCM199中胱氨酸的含量相对较高（83.2μmol/L），有实验证明像半胱胺和β-巯基乙醇这样的低分子量的巯基物质能够通过还原胱氨酸为半胱氨酸，并通过促进细胞对半胱氨酸的利用来促进GSH合成。

目前的实验结果表明，GSH的合成取决于培养液中半胱氨酸的利用，半胱氨酸是唯一的氨基酸前体，在卵母细胞中通过丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸运输体系被吸收。然而，在细胞外环境中半胱氨酸非常不稳定，易被氧化成胱氨酸，降低GSH的合成。牛体外成熟培养液中添加胱氨酸仅能促进COCs GSH的合成，卵丘细胞在将胱氨酸转化为半胱氨酸过程中发挥了重要的作用。IVM培养液中同时添加半胱胺和胱氨酸，在没有卵丘细胞存在的条件下也提高了卵母细胞中的GSH含量。低分子量的巯基化合物，例如半胱胺和β-巯基乙醇，添加到成熟培养液中能够提高GSH水平，改善猪体外受精卵母细胞发育能力。

（三）研究的主要内容

针对性成熟前动物得到的卵母细胞发育能力差这个问题，我们以不同周龄的小鼠为研究模型，进行了以下几个方面的研究，希望能找出性成熟前动物卵母细胞发育能力差的原因，从而提高性成熟前动物卵母细胞发育能力。

①卵泡直径和卵母细胞直径是衡量卵母细胞质量的一个指标，直径大的卵泡卵母细胞发育能力显著高于小直径的卵泡卵母细胞，卵泡和卵母细胞发育同步化程度反映卵泡内颗粒细胞的数量，这些问题在性成熟前后卵泡、卵母细胞上是否有差别。

②多精受精是性成熟前动物卵母细胞体外受精后普遍存在的问题，多精受精导致胚胎发育异常或发育阻滞，所以我们需要深入研究多精受精产生的原因，降低多精受精比例，提高囊胚发育率。

③促性腺激素能增加大的有腔卵泡的数量，但是对卵母细胞发育能力的影响众说纷纭，我们以小鼠为实验模型继续深入研究促性腺激素对性成熟前动物卵母细胞发育能力、多精受精情况的影响。

④谷胱甘肽是卵母细胞胞质中存在能够促进雄原核形成的物质，近年来被普遍认为是卵母细胞胞质成熟的指标，成熟培养液中添加胱氨酸和半胱氨酸能够促进卵母细胞胞质中谷胱甘肽的合成，从而改善卵母细胞发育能力，这在性成熟动物中都已经被证明，能否改善性成熟前动物卵母细胞发育能力，以及改善的程度值得研究。

⑤对于卵母细胞胞质中谷胱甘肽合成来说，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和GSH合成酶是最为关键的两个酶，其中γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶包括催化亚基（GCLC）和调节亚基（GCLM），这些酶在性成熟前后小鼠卵母细胞中表达是否存在差别需要进行研究。

⑥促性腺激素对卵母细胞胞质中GSH的合成能力以及对GSH合成最为关键的两个酶是否存在影响，需要我们进行研究。

二、材料与方法

（一）主要试剂及配制

若无特殊说明，实验所用试剂均购自Sigma公司。试剂配制及分装时所用的玻璃器皿都是采用170℃高温干热2h以上灭菌的；塑料平皿都是采用紫外灯照射40min以上灭菌的；其他塑料器皿都经过120℃、1.5个大气压湿热灭菌15～30min。

卵母细胞成熟培养液：TCM-199（Gibco，Grand Island，New York，USA）添加10%（体积分数）FCS（GIBCO）、24.2mg/L丙酮酸钠、0.05IU/ml FSH、0.05IU/ml LH、1μg/ml 17β-雌二醇、10ng/ml EGF、100IU/ml的青霉素和0.05mg/ml硫酸链霉素。半胱胺和胱氨酸分别配制成20mmol/L和100mmol/L浓储液，培养时根据实验需要用成熟培养液进行稀释使用。培养条件为：20～30枚卵母细胞/100μl成熟培养液，覆盖石蜡油，37℃，5%CO₂，100%湿度。

M2操作液：每100ml七蒸水中加入NaCl 0.55319g、KCl 0.03563g、CaCl₂·2H₂O 0.02514g、KH₂PO₄ 0.016195g、MgSO₄ 0.0143276g、NaHCO₃ 0.035g、Hepes 0.496855g、乳酸钠0.4349g、丙酮酸钠0.00363g、葡萄糖0.1001912g、BSA 0.4g、青霉素0.006g、链霉素0.005g、酚红钠0.001g。

获能及授精液：基础液为T6液（Quinn等，1982），每100ml七蒸水中加入NaCl 0.666g、KCl 0.0238g、MgCl₂.6H₂O 0.01g、CaCl₂·2H₂O 0.0294g、NaH₂PO₄·2H₂O 0.016195g、NaHCO₃ 0.209g、葡萄糖0.1g、丙酮酸钠0.0055g、乳酸钠0.1121g、Hepes 0.24g、酚红钠0.001g。获能液为T6+10mg/mlBSA，受精液为T6液+20mg/mlBSA。

SrCl₂激活液：先用七蒸水将SrCl₂配成100mmol/l浓储液，保存于4℃，激活前用无Ca无糖CZB将其稀释10倍。

胚胎培养液：无糖CZB液，即每100ml超纯水中加入NaCl 0.476987g、KCl 0.036008g、KH₂PO₄ 0.01606g、MgSO₄ 0.0144207g、NaHCO₃ 0.211033g、CaCl₂·2H₂O 0.0250g、乳酸钠0.350748g、丙酮酸钠0.00297g、EDTA 0.004094g、谷氨酰胺0.01461g、BSA 0.5g、青霉素0.006g、硫酸链霉素0.005g。含糖CZB液，即在无糖CZB的基础上每100ml添加0.1g葡萄糖。

（二）实验动物及超排处理

本实验使用的小鼠均为昆明白品系，自繁自养。实验所用雌鼠为成年鼠6～8周，幼鼠19～21d，雄鼠为8～12周龄。控光（黑暗20：00～次日6：00；光照6：00～20：00）超排处理：腹腔注射PMSG 10IU/只，46h后取GV期卵母细胞。

（三）卵母细胞的获取及体外成熟

体外成熟卵母细胞的获取：雌鼠腹腔注射10IU PMSG/只，46h后颈椎脱臼法杀鼠摘取卵巢。剔除卵巢周围的脂肪组织和输卵管，用M2清洗两遍，洗去血液和脂滴。把卵巢置于M2操作液中，在实体显微镜下，用刺卵针挑破卵巢表面直径大于320μm的有腔卵泡，收集卵丘卵母细胞复合体（COCs）。从收集的COCs中选取达到最大直径（＞70μm）、卵丘完整而且致密、层数在三层以上、卵母细胞形状规则、胞质均匀无颗粒、胞质颜色正常，呈均匀的浅黄色的GV期COCs，成熟培养液洗涤3遍后培养。

卵母细胞的体外成熟培养：采用微滴培养体系，严格控制培养条件（每个培养液滴体积为100μl），表面覆盖薄层石蜡油，预平衡2h后用于培养，每滴培养30枚左右卵母细胞。将洗涤后的卵母细胞移入已平衡好的培养液滴中，置于37.5℃、5%CO₂、95%空气、饱和湿度的CO₂培养箱内进行培养。从杀鼠至培养的全部操作限制在40min内完成。

（四）卵母细胞体外受精

选取性成熟（10～12周龄）昆明白雄鼠，已通过交配实验证明其有受精能力，颈椎脱臼法处死，从附睾尾和输精管收集精子，将收集的精子团块置入1ml含10mg/ml BSA的T6液滴内，用口吸管轻轻吹打，使精子团分散开，于37℃、5%CO₂及饱和湿度的CO₂培养箱内中孵育1.5h左右，进行获能。在此期间用细胞计数板检测精子密度。将hCG后12h或IVM14h的卵母细胞在受精液（T6+20mg/mlBSA）中洗3次，移入已经平衡过夜的受精滴（20枚/40μl）中，加入适量体积的获能精子，使精子密度在1×10⁶个/ml左右。培养6h后，用无糖CZB液洗去卵母细胞周围附着精子，选取含两原核和第二极体的受精卵，置于无糖CZB中培养。

（五）氯化锶激活

体外成熟卵母细胞（COCs要提前脱卵丘）分别用M2液及含20mmol/L SrCl₂的无钙无糖CZB液洗3遍，然后将卵母细胞置于含20mmol/L SrCl₂的无钙无糖CZB液中培养2.5h，之后转入不含SrCl₂的无糖CZB液中继续培养3.5h，即在激活处理6h后观察原核、统计激活率。

为了维持孤雌激活胚胎的二倍性，激活液和6h检查原核前短期培养的培养液中均添加5μg/ml的CB。

（六）胚胎培养

将孤雌激活或体外受精后的卵母细胞移入不含CB的无糖CZB中继续培养。当有2/3的胚胎到达4-细胞时，将胚胎换液于含5.5mmol/L葡萄糖的CZB中继续培养至发育到囊胚。在激活或受精后的48h、72h、96h各观察1次，记录4-细胞、桑椹胚和囊胚的发育情况。

（七）多精受精观察

体外受精8h取出受精卵，用孔径与受精卵直径接近的撸卵针将周围的精子去掉，放在玻璃载玻片上制成标本。标本用醋酸酒精溶液（体积比1∶3）固定至少24h后，用1%醋酸地衣红染色，相差显微镜下观察多精受精情况，将两原核两极体（或只有第二极体）的视为正常受精，多于进入卵母细胞的视为多精受精。原核直径测量：体外受精8h后，将两原核受精卵取出压片，压片时，盖玻片四边中点各放宽约20μm，厚度相同的塑料，使卵母细胞被压扁的程度相同。标本用醋酸酒精溶液（体积比1∶3）固定至少24h后，用1%醋酸地衣红染色，在带有目镜测微尺的相差显微镜下测量雌雄原核直径，结果为两者平均值。

（八）发情周期观察

整个发情周期都伴随着血液中激素浓度的高低变化，阴道上皮细胞也随之变化，所以借助阴道黏液镜检，根据其中所含阴道上皮细胞形态，可对其发情周期所处的阶段进行判断。具体做法是暴露小鼠阴道，右手持滴管吸少量灭菌生理盐水滴入阴道口，当稍放松尾部及腰部时，生理盐水即被吸入阴道，稍候三指轻压腰部，黏液随生理盐水流出，吸入滴管中，滴到载玻片上涂片，片子自然干燥后用酒精（95%）固定5min，然后用1%伊红染液染15min，水洗干燥后在光学显微镜下观察。

根据阴道上皮细胞变化情况，将发情周期分为以下4个阶段。

Ⅰ期（发情前期）：黏液中有上皮细胞，有核细胞居多。

Ⅱ期（发情期）：涂片中几乎全是无核的或有核的角化上皮细胞，细胞大而扁平，边缘不整齐。

Ⅲ期（发情末期）：少量较老的有核细胞呈散在，其间有许多白细胞。

Ⅳ期（间情期）：涂片中几乎全是白细胞。

在整个过程中对小鼠的操作动作小心轻柔，向阴道口滴与从阴道口回吸生理盐水时吸管尽量不碰到阴唇。

（九）卵母细胞谷胱甘肽含量的测定

根据1994年Funahashi等采用的方法进行卵母细胞谷胱甘肽含量检测。将未成熟和不同条件下成熟的卵母细胞脱卵丘，M2洗3次后用无菌蒸馏水再洗2次。将洗涤后的卵母细胞（35～40个）移入含5μl蒸馏水和5μl 1.25mmol/L磷酸的1.5ml离心管中。若不立即检测活性，可将样品存于-70℃备用。若立即检测活性，可将样品反复冻融3次，然后应用DTNB-GSSG还原酶实验检测GSH含量。向样品离心管中加入700μl封闭缓冲液（含有0.33mg/ml NADPH，0.2mmol/L磷酸钠，10mmol/L EDTA；调整缓冲液pH值为7.2），100μl含6mmol/L DTNB液，然后加入10μl 250IU/ml GSH还原酶，迅速混匀以起始反应。用可见光分光光度计在412nm处检测光吸收值，每30s中记录1次数据，记录3分钟内的几次光吸收值。本实验中需同时检测标准GSH样品（分别含0.01mmol/L、0.02mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、1.0mmol/L GSH）和空白样品（不含GSH）的光吸收值，以作为阳性和阴性对照。将每个样品的GSH含量除以样品所包含的卵母细胞数即为每个卵母细胞的GSH含量。

（十）皮质颗粒染色

除特殊说明外，所有的实验步骤均在室温下进行。将收集的体内及体外成熟卵母细胞、受精卵和孤雌激活卵在含0.5%链霉蛋白酶（Roche）的M2液中于37℃消化3～5min，除去透明带。卵母细胞在M2中洗3次后，用含3.7%多聚甲醛的PBS在室温下至少固定30min；然后用封闭液（blocking solution含0.3% BSA和100mM甘氨酸的M2）洗3次，每次至少5min；用含0.1% TritonX-100的M2处理5min；用blocking solution清洗2次后，在避光条件下，卵母细胞在含100μg/ml异硫氰酸荧光素标记的扁豆凝集素（FITC-LCA）的M2中至少孵育30min。然后用含0.3% BSA和0.01% TritonX-100的M2洗3次，每次5min，卵母细胞核用含10μg/ml碘化丙锭（PI）的M2孵育10min，以评价细胞核的阶段和精子穿透。用M2充分清洗后，卵母细胞被放在玻璃载玻片上制成标本，放到暗盒中待观察。

（十一）激光扫描共聚焦显微术

制备好的样品，用装有氪-氩离子激光管的Leica TCS SP Ⅱ型激光扫描共聚焦显微镜观察并照相。Hoechst 33342的荧光用二极激光管的405nm波长激发。FITC和PI的荧光用Ar/ArHr激光管的488nm波长激发，发射光通过一个488nm的滤片。单个的视觉截面是假颜色，用Leica共聚焦软件组合成一个复合的图片。

（十二）卵泡直径、卵母细胞直径的测量

用扎卵针分离性成熟前后小鼠卵泡，在带有目镜测微尺的显微镜下测量，划破卵泡，取出卵母细胞，测量卵母细胞的直径，显微镜倍数为400倍。

（十三）定量PCR

1.药品

药品见表1-1。

2.仪器

仪器见表1-2。

3.主要数据库

GenBank：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov.

4.试剂配制

5×TBE电泳缓冲液：750ml双蒸水中溶解54g Tris · base、27.5g硼酸、4.65g EDTA。

50×TAE电泳缓冲液：750ml双蒸水中溶解242g Tris碱，加入57.1ml冰乙酸、100ml 0.5M EDTA（pH8.0），用双蒸水定容至1000ml。

0.1%DEPC处理水：1000ml双蒸水加1ml DEPC，混匀，37 ℃过夜，高压灭菌

5. RNA的提取

凡与RNA操作有关的玻璃器皿和剪刀、镊子等器械经常规洗涤烘干后，用锡箔纸包好，200℃烘烤2～4h。塑料制品用0.1% DEPC浸泡处理37℃ 2h，或室温处理过夜，再用灭菌双蒸水漂洗数次，高压灭菌去除DEPC。

GV期卵丘卵母细胞复合物，离心（2000～3000g/5～10min）弃上清，加入适量trizol，剧烈振荡15s至液体澄清，-70℃保存，trizol终体积500μl。

①向trizol离心管中加100μl氯仿，剧烈振荡15s，室温静置2～3min。

②4℃ 12000g离心15min，见分层。

③用黄枪头吸取上层水相，约200μl，置另一离心管中（不要吸到中间层的有机相）。

④向离心管中加入等体积的异丙醇，混匀，室温放置10min，现RNA沉淀。

⑤DEPC·H₂O配75%乙醇。

⑥离心完后弃上清，加500μl 75%乙醇，用指轻弹管壁使RNA沉淀飘起。

⑦4℃ 7500g离心15min，沉淀即总RNA，弃乙醇，用离心机再甩一下离心管，用黄枪头将乙醇吹出，打开管盖，稍凉。

⑧加入10μl DEPC·H₂O，轻弹几下让RNA溶解。

⑨分装后-80℃保存。

6. RNA浓度和质量检测

分别采用1.5%普通琼脂糖凝胶电泳和分光光度计法检测定RNA的抽提质量和浓度。根据测定浓度将各RNA样品稀释为1μg/μl。电泳检测RNA提取质量，所提取RNA A₂₆₀/A₂₈₀在1.8～2.0之间时，用作RT-PCR分析。

7. cDNA的合成

cDNA合成参照Invitrogen公司的SuperScriptⅢ^TM Reverse Transcriptase说明书进行。采取20μl体系进行反转录，具体操作如下。

①在DEPC处理过的0.2mL反应管中加入相关混合液（表1-3）。

②PCR仪中65℃保温5min，迅速取出置于冰上急冷2min以上，这样可以减弱二级结构的影响，提高反转录效率。

③高速离心数秒使模板RNA、引物等混合液聚集于管底。

④配制反转录反应液（表1-4）。

⑤PCR仪中50℃保温1h，然后70℃保温15min后冰上冷却，-20℃保存待用。

8. QPCR反应

（1）定量PCR所用引物设计及合成　根据GeneBank中已公布的小鼠Gclc、Gclm、Gss、Gapdh基因序列，根据跨内含子的引物设计原则，分别利用DNAMAN、OLIGO6.0、Prime5.0软件设计各基因引物，交由上海生物工程公司合成。将合成的引物用DEPC处理的五蒸水配制成100μmol/L的原液，-20℃保存，使用时稀释为10μmol/L的工作液。定量PCR所用引物见表1-5。

（2）实时荧光定量PCR

①荧光定量PCR反应体系。实时荧光定量PCR采用SYBR Green I染料法，采用Stratagene公司的BrilliantⅡSYBR Green QPCR Mastr Mix试剂盒方法进行。反应在Stratagene MX3000P荧光定量PCR仪上进行。反应体系10μl，体系成分见表1-6。

②定量PCR标准曲线、扩增曲线、溶解曲线的获得。对用于定量的每个模板取等量cDNA混匀到一个PCR管内，依次进行5×梯度稀释，制作5～7个浓度梯度（即原始浓度、5×、25×、125×、625×，依此类推）。目的基因和持家基因均按照上述PCR步骤进行扩增，得到标准曲线。根据斜率（k）计算出扩增效率，计算公式为扩增效率e=10^1/（-k）-1。当目的基因的扩增效率和持家基因的扩增效率相近（即二者的斜率相差不超过0.2）时，可以使用“平均相对含量=2^-△△ct”法来计算该基因的相对表达量。具体计算方法参照Livak and Schmitten（2001）的方法。

标准曲线符合条件后，选择合适的稀释倍数，对每一个cDNA样品分别进行目的基因和持家基因的扩增，单个样品均做3次重复，得到ct值，选择ct值变异系数小于1.5%的用于计算每个样品的平均ct值。

溶解曲线和扩增曲线程序自动给出，溶解曲线呈单峰为特异性扩增。

③基因mRNA相对表达量计算方法。本实验采用SYBR Green荧光染料法进行实时荧光定量PCR扩增的检测。SYBR Green实时定量PCR是通过对PCR扩增过程中荧光信号的变化实时监测PCR每一循环扩增产物量的变化。熔解曲线鉴定PCR产物的特异性，如果在引物设计后预期产物T_m值处出现单一的曲线峰表示PCR产物是特异性的，而非特异性产物形成多个分离的曲线峰。ct值是反应体系内荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数，通过测定ct值可反映出基因起始模板浓度，ct值越小则模板浓度越大，反之越小。以管家基因（GAPDH）作为内标基因，通过对待测基因以及内标基因的均一化处理可测定出待测基因转录表达的相对量。因为管家基因表达量相对稳定，受外界因素影响后表达变化小。

（十四）实验结果统计及数据分析

试验数据用SPSS 11.0软件进行统计。试验数据经反正弦转换后符合正态分布，在One-Way ANOVA Options中通过Descriptive统计学分析获得平均数和标准误，在One-Way Analysis of Variance中通过LSD多重比较进行试验组间差异性分析。P＜0.05为差异显著。

三、结果与分析

（一）性成熟及促性腺激素对小鼠卵母细胞体外发育能力的影响

本实验我们研究了不同周龄小鼠卵母细胞经体外成熟、受精后的发育能力，以及注射PMSG对性成熟前后小鼠卵母细胞发育能力的影响。小鼠卵母细胞，体外成熟14h，受精后，记录2-细胞、4-细胞和囊胚比例。结果见表1-7。

结果表明，幼鼠卵母细胞经体外受精后卵裂率、囊胚发育率都显著低于成年鼠（8.8% Vs 38%），4周小鼠卵母细胞囊胚发育率接近成年鼠水平（30% Vs 38%），注射PMSG能显著提高性成熟前后小鼠卵母细胞发育能力，幼鼠由8.8%提高到51.1%，成年鼠由38%提高到57.5%，幼鼠卵母细胞发育能力达到了成年鼠水平。

（二）性成熟及促性腺激素对小鼠卵母细胞体外受精后多精受精情况及正常受精受精卵原核直径的影响

本实验研究性成熟和促性腺激素对小鼠卵母细胞体外受精后，多精受精及两原核受精卵原核直径的影响。卵母细胞体外受精8h后，用孔径接近卵母细胞直径的撸卵针将卵母细胞周围的精子去掉，在载玻片上制成标本，醋酸酒精溶液（体积比1∶3）固定至少24h，用1%地衣红染色，相差显微镜下观察正常受精和多精受精及正常受精的受精卵的原核直径，正常受精为两原核加一个或两个极体，多精受精为多于一个精子进入卵母细胞，精子穿透率为正常受精和多精受精总和。原核直径测量：压片时，盖玻片四边中点各放宽约20μm、厚度相同的塑料，使卵母细胞被压扁的程度相同，在带有目镜测微尺的相差显微镜下测量，结果为雌雄原核直径平均值。

结果证明，性成熟前后小鼠卵母细胞经体外受精后，精子穿透率没有差别，注射PMSG能显著提高精子穿透率（幼鼠80.9% Vs 95.5%，成鼠86.0% Vs 95.1%）；幼鼠卵母细胞多精受精比例显著高于成鼠（54.3% Vs 37.7%），且幼鼠多精受精没有形成原核的比例显著高于成年鼠（74.9% Vs 38.3%），两原核受精卵原核直径在成鼠和幼鼠之间没有显著差异；PMSG处理显著提高了性成熟前后小鼠卵母细胞两原核受精卵的比例（幼鼠27.1% Vs 69.9%，成鼠48.9% Vs 74.5%），降低了多精受精（幼鼠54.3% Vs 26.2%，成鼠37.7% Vs 20.6%）和受精后未形成原核（幼鼠74.9% Vs 16.2%，成鼠38.3% Vs 11.3%）的比例，原核直径也有显著提高，幼鼠原核直径由27.78μm显著提高到41.67μm，成年鼠原核直径没有显著提高，注射PMSG前后分别为34.25μm、40.42μm，幼鼠受精卵原核直径达到了成鼠水平。表1-8为性成熟前后小鼠卵母细胞体外受精后受精情况及两原核受精卵原核直径的比较。

（三）性成熟及促性腺激素对小鼠卵母细胞体外受精后正常受精卵（两原核受精卵）发育能力的影响

本实验研究性成熟及促性腺激素对小鼠卵母细胞体外受精后正常受精卵（两原核受精卵）发育能力的影响卵母细胞经体外成熟、受精后选取两原核受精卵体外培养，记录受精率及囊胚发育率。

结果表明（表1-9），性成熟前小鼠卵母细胞经体外受精后正常受精比例显著低于成年鼠（30.6% Vs 46.0%），注射PMSG后显著提高了正常受精的比例（幼鼠30.6% Vs 79.7%，成鼠46.0% Vs 76.7%），幼鼠正常受精比例达到成年鼠水平；两原核受精卵体外培养后，幼鼠囊胚发育率显著低于成年鼠（幼鼠14.8% Vs 44.5%，成鼠35.6% Vs 45.9%），注射PMSG后显著提高了性成熟前后卵母细胞的囊胚发育率，幼鼠由14.8%提高到44.5%，成鼠由35.6%提高到45.9%，且幼鼠达到成鼠水平。

（四）发情周期对成年鼠卵母细胞发育能力的影响

考虑到发情周期对成年鼠卵母细胞发育能力的影响，我们选择前期和间期小鼠卵母细胞进行体外成熟、受精以及受精卵的体外培养，观察发情周期对成年鼠卵母细胞发育能力是否有影响。

结果表明，前期和间期小鼠卵母细胞经体外成熟、受精后，卵母细胞受精率及囊胚发育率都没有差别，前期和间期小鼠受精率分别为39.4%和45.9%，囊胚发育率分别为27.8%和30.8%，结论是成年鼠的发情周期对卵母细胞发育能力没有影响。

（五）性成熟及促性腺激素对小鼠卵母细胞体外成熟后皮质颗粒分布的影响

不同周龄小鼠卵母细胞体外成熟14h后，按材料方法进行CGs染色和激光共聚焦显微镜观察。根据2005年Liu等对卵母细胞皮质颗粒分布阶段的描述，MⅡ期卵母细胞的皮质颗粒应该沿质膜下呈线状排列，在纺锤体的上方出现无皮质颗粒区，卵母细胞成熟后皮质颗粒迁移不完全或提前发生胞吐都会导致多精受精。

结果表明，体外成熟后3周和4周小鼠卵母细胞皮质颗粒迁移不完全比例没有显著差别（71.1% Vs 63.9%），4周和6～8周皮质颗粒迁移不完全比例没有显著差别（63.9% Vs 58.7%），6～8周皮质颗粒迁移不完全比例显著低于3周小鼠，比例分别为71.1%和58.7%；注射PMSG后显著提高了皮质颗粒迁移完全的比例，3周小鼠皮质颗粒迁移完全的比例从21.9%提高到70.1%，6～8周小鼠皮质颗粒迁移完全的比例从36.7%提高到73.4%，3周和6～8周小鼠卵母细胞皮质颗粒迁移完全的比例没有显著差别，提前胞吐的比例在性成熟前后及注射PMSG前后都没有差别。（表1-11）

（六）性成熟及促性腺激素对小鼠卵母细胞胞质中GSH含量的影响

本实验研究不同周龄小鼠卵母细胞体外成熟后，卵母细胞胞质中GSH含量，及注射PMSG后对GSH含量的影响。体外成熟14h的MⅡ卵母细胞，按材料方法检测GSH含量。结果表明，体外成熟后，3周小鼠卵母细胞胞质中GSH含量显著低于4周和6～8周，分别为1.68pmol/Oocyte、2.28pmol/Oocyte和2.46pmol/Oocyte，4周和6～8周GSH含量没有差别，注射PMSG能显著提高性成熟前后小鼠卵母细胞胞质中GSH含量。幼鼠卵母细胞GSH含量达到了成年鼠水平（2.94pmol/Oocyte Vs 2.96pmol/Oocyte）（表1-12）。

（七）添加胱氨酸和半胱胺对性成熟前后小鼠卵母细胞及促性腺激素处理的小鼠卵母细胞发育能力的影响

本实验中，我们研究了向成熟培养液TCM-199中添加胱氨酸和半胱胺对性成熟前后自然周期小鼠卵母细胞及促性腺激素处理的小鼠卵母细胞发育能力的影响。结果如下（表1-13）。

①添加胱氨酸（100μmol/L）和半胱胺（200μmol/L）能显著提高性成熟前后小鼠卵母细胞胚胎发育能力，幼鼠囊胚发育率由15.5%提高到24.0%，成鼠由30.1%提高到38.7%，幼鼠卵母细胞囊胚发育率还是低于成年鼠。

②将胱氨酸和半胱胺浓度提高1倍后（200μmol/L、400μmol/L），性成熟前后卵母细胞发育能力没有继续得到提高，幼鼠囊胚率24.0% Vs 27.8%，成鼠为38.7% Vs 38.2%，幼鼠卵母细胞发育能力显著低于成年鼠。

③添加胱氨酸（200μmol/L）和半胱胺（400μmol/L）能显著提高处理PMSG的性成熟前后小鼠卵母细胞发育能力，囊胚发育率幼鼠从40.9%提高到51.7%，成鼠从43.8%提高到60.2%。

（八）添加胱氨酸和半胱胺对性成熟前后小鼠卵母细胞胞质中GSH含量的影响

由表1-13我们得出，添加胱氨酸（100μmol/L）和半胱胺（200μmol/L）能显著提高性成熟前后小鼠卵母细胞胚胎发育能力，将浓度增加1倍后（200μmol/L、400μmol/L），性成熟前后卵母细胞发育能力没有继续得到提高，卵母细胞发育能力的提高是否与卵母细胞胞质中GSH含量的变化有关？我们检测了添加胱氨酸和半胱胺后，性成熟前后小鼠MⅡ期卵母细胞胞质中GSH水平。结果表明（表1-14），幼鼠添加胱氨酸（100μmol/L）和半胱胺（200μmol/L）后，卵母细胞胞质中GSH含量显著增加，添加胱氨酸（200μmol/L）和半胱胺（400μmol/L）后，GSH水平没有继续得到显著增加；成年鼠添加胱氨酸（100μmol/L）和半胱胺（200μmol/L）后，卵母细胞胞质中GSH含量没有显著提高，添加胱氨酸（200μmol/L）和半胱胺（400μmol/L）后，GSH含量显著增加，添加胱氨酸（100μmol/L）和半胱胺（200μmol/L）及胱氨酸（200μmol/L）和半胱胺（400μmol/L）的卵母细胞胞质中GSH水平没有显著差异；添加胱氨酸和半胱胺前后，性成熟前小鼠卵母细胞胞质中GSH水平都显著低于成年鼠；注射PMSG的小鼠，添加胱氨酸（200μmol/L）和半胱胺（400μmol/L）后，性成熟前后小鼠卵母细胞胞质中GSH水平都显著提高。

（九）性成熟和促性腺激素对性成熟前后小鼠卵母细胞谷胱甘肽合成途径酶表达的影响

GSH合成途径有两种酶，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（GCL）和GSH合成酶（GSS），其中γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶有催化亚基（GCLC）和调节亚基（GCLM）组成，分别由不同的mRNA编码，催化亚基催化半胱氨酸和谷氨酸结合形成γ-谷氨酰半胱氨酸，调节亚基没有催化活性，但能与催化亚基结合，调节催化亚基的催化效率，调节反应速度。本实验取性成熟前后小鼠GV期卵丘卵母细胞复合物，检测GSH合成途径中的酶表达。

总RNA的提取与检测：经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，RNA的完整性和纯度均符合反转录的要求，结果如图1-3所示，清晰可见5S、18S、28S三条条带。经紫外分光光度计测定，所提取的总RNA在260nm的紫外吸收值与280nm的紫外吸收值比值均在1.8～2.0间，说明无蛋白质和其他杂质污染。因此，提取的总RNA质量完好，可用于进一步RT-PCR和定量PCR。

定量PCR标准曲线、溶解曲线、扩增曲线的获得：试验采用相对定量比较ct值法检测mRNA的含量，图1-4是持家基因GAPDH标准曲线制作图，可以看出倍比稀释的各点成一直线，扩增效率99%，扩增曲线（图1-5）显示扩增产物呈S形曲线，检测到荧光信号峰值较高，熔解曲线（图1-6）为锐利的单峰，没有杂峰，说明检测的ct值可靠。

1.GSH合成酶（GSS）mRNA表达

以反转录产物作为模板，使用特异性引物进行扩增，PCR产物经1.5%琼脂糖电泳检测。电泳结果显示目的基因cDNA的扩增能获得特异性产物，其扩增片段长度为122bp，GAPDH扩增片段长度为244bp。结果表明，性成熟前后小鼠卵母细胞GSS mRNA表达没有差异（1 Vs 2.11，T检验），注射PMSG后显著提高了性成熟前后小鼠卵母细胞GSS mRNA表达，幼鼠由1提高到19.59，成鼠由2.11提高到36.2，成鼠和幼鼠之间没有差异（T检验）（图1-7、图1-8）。

2.谷胱甘肽还原酶（GSS）mRNA表达

以反转录产物作为模板，使用特异性引物进行扩增，PCR产物经1.5%琼脂糖电泳检测。电泳结果显示目的基因cDNA的扩增能获得特异性产物，其扩增片段长度为135bp。结果表明，经T检验后，性成熟前后小鼠卵母细胞GCLC mRNA表达差异显著（1Vs 2.28，T检验），注射PMSG后显著提高了性成熟前后小鼠卵母细胞GCLC mRNA表达，幼鼠由1提高到8.69，成鼠由2.28提高到11.04，成鼠和幼鼠之间没有差异（T检验）（图1-9、图1-10）。

3. γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶调节亚基（GCLM）mRNA表达

以反转录产物作为模板，使用特异性引物进行扩增，PCR产物经1.5%琼脂糖电泳检测。电泳结果显示目的基因cDNA的扩增能获得特异性产物，其扩增片段长度为284bp。结果表明，经T检验后，性成熟前后小鼠卵母细胞GCLC mRNA表达差异显著（1Vs 4.55，T检验），注射PMSG后显著提高了性成熟前后小鼠卵母细胞GCLC mRNA表达，幼鼠由1提高到24.16，成鼠由4.55提高到12.2，成鼠和幼鼠之间没有差异（T检验）（图1-11、图1-12）。

（十）体外成熟小鼠卵母细胞最佳SrCl₂激活浓度的研究

为了使体外培养的小鼠卵母细胞获得较高的孤雌激活率及囊胚发育率，本研究对孤雌激活最佳SrCl₂浓度进行了筛选。选择注射PMSG的成年鼠体外成熟24h的卵母细胞，结果表明，30mmol/L SrCl₂浓度激活率最低78.1%，囊胚发育率为0，都显著低于其他浓度；20mmol/L SrCl₂浓度得到的激活率和囊胚发育率最高（97.7% Vs 25.9%）（表1-15）。

（十一）性成熟和促性腺激素对小鼠卵母细胞孤雌激活后胚胎发育能力的影响

体外成熟24h的性成熟前后小鼠卵母细胞，用浓度20mmol/L的SrCl₂激活，然后进行胚胎培养。结果表明（表1-16），3周、4周和6～8周小鼠卵母细胞，不管是COCs还是DO，成熟率和孤雌激活率都没有差别；孤雌激活后的囊胚发育率不管是COCs还是DO，3周都显著低于4周和6～8周，4周和6～8周囊胚发育率没有显著差别。COCs囊胚发育率分别为3周5.8%、4周11.1%、6～8周13.5%，DO囊胚发育率分别为3周0%、4周4.1%、6～8周5.6%，4周（27～28d）小鼠卵母细胞发育能力和成年鼠没有差异，说明已经接近性成熟。

（十二）性成熟前后小鼠卵泡和卵母细胞发育同步化程度

卵泡和卵母细胞发育同步化程度，反映颗粒细胞增殖程度和卵母细胞生长同步化程度以及能否用卵泡大小判断卵母细胞发育能力（Lucas等，2003；Grazyna Ptak，2006）。我们选择300μm以上的卵泡，测量卵母细胞直径，结果表明，幼鼠和成年鼠卵泡和卵母细胞发育同步化程度相近（r=0.45Vs r=0.56），且性成熟前后小鼠卵母细胞直径没有差别（77.78±0.56μmVs 77.06±0.71μm），卵泡直径也没有差别（358.5±6.1μmVs 353.6±7.8μm）（图1-13）。

四、讨论

（一）性成熟和促性腺激素对小鼠卵母细胞体外发育能力的影响

卵母细胞发育能力是指卵母细胞经成熟、受精或者孤雌激活后发育到胚胎特定时期的能力，本文主要研究发育到早期囊胚的能力。利用幼畜体外成熟卵母细胞能够最大限度地缩短世代间隔，加速品种改良。虽然利用性成熟前动物体外成熟、受精卵母细胞已经成功地获得了后代（Revel等，1995；O’Brien等，1997；Khatir等，1998a；Ptak等，1999），但是性成熟前动物卵母细胞发育能力比成年动物差，得到的胚胎移植后胎儿死亡的比例高，死亡原因不得而知（Seidel等，1971；Pinkert等，1989；Eppig等，1992；Revel等，1995；Damiani等，1996；Khatir等，1996；O’Brien等，1996；1997，Ledda等；1997，Izquierdo等，1999；Wu等，2007）。在小鼠上我们证明，核成熟率没有差别这与以前报道小鼠和其他物种的结果相一致（Wu等，2007），不论是体外受精还是孤雌激活后的囊胚发育率幼鼠都显著低于成年鼠，4周（27～29d）小鼠卵母细胞发育能力显著高于3周小鼠，达到了成年鼠水平，3～4周龄卵母细胞发育能力迅速提高，这与Eppig and Schroeder（1987）发表的未处理促性腺激素的小鼠卵母细胞随着年龄增长（16～28d）、卵母细胞发育能力逐渐提高的结论一致。去除卵丘细胞对卵母细胞发育能力的影响，性成熟前后裸卵母细胞发育能力也存在差异。

激素处理能够提高性成熟前卵母细胞发育能力在多种动物上得到了证明，也有一些文章认为激素处理对卵母细胞发育能力没有作用或有副作用。促性腺激素能够增加大的有腔卵泡的数量，引起卵泡颗粒细胞增殖，诱导LHR的合成和类固醇生成酶的表达，调节卵泡内的激素微环境。促性腺激素对卵母细胞发育能力的作用有两种说法，一种认为促性腺激素作用于卵泡颗粒细胞，诱导信号，增加细胞内cAMP水平（Loutradis等，1987，1994），通过缝隙连接传递给卵母细胞，cAMP是一种重要的信号分子，调节卵母细胞成熟（Tsafriri等，1972），卵母细胞体外成熟由于脱离了卵泡内的抑制环境，使细胞核成熟早于细胞质成熟，核质成熟不同步，增加细胞内cAMP水平，能抑制卵母细胞核提前成熟，使细胞质有足够的时间完成成熟，改善卵母细胞发育能力。另一种认为激素能够直接作用于卵母细胞，因为在仓鼠的卵母细胞上发现了促性腺激素受体。我们的实验结果表明，性成熟前后小鼠注射PMSG后，COCs经体外受精和孤雌激活后以及DO孤雌激活后，卵母细胞发育能力都得到了显著改善，幼鼠卵母细胞发育能力达到了成年鼠水平。

（二）性成熟及促性腺激素对小鼠卵母细胞体外受精后多精受精情况及正常受精受精卵原核直径的影响

性成熟前动物卵母细胞体外受精后多精受精比例高于成年动物在猪、山羊、绵羊等动物都有证明（O’Brien等，1997）。多精进入会引起胚胎染色体异常，从而导致胚胎死亡。多精受精发生的原因是卵母细胞胞质成熟不完全，透明带异常。卵母细胞胞质中的皮质颗粒参与阻止多精受精，卵母细胞成熟不够会造成皮质颗粒释放障碍，引起多精受精，与成熟的卵母细胞相比，未成熟卵由于不能发生完善的皮质反应和透明带反应呈现较高的多精受精率。我们的实验结果证明：性成熟前后小鼠卵母细胞经体外受精后，精子入卵率没有差别，注射PMSG能显著提高精子入卵率；多精受精比例幼鼠显著高于成鼠，且幼鼠多精受精没有形成原核的比例显著高于成年鼠，这在性成熟前山羊上也有相同的报道（A.Martino等，1994；Mogas等，1997）。

精子进入卵母细胞后，卵母细胞中形成雄原核生长因子（MPGF），MPGF可能是像核质素（nucleoplasmin）一样的物质，是精核去致密所必需的。维持雌、雄原核形成所必需的物质，其数量是有限的，当精子进入卵中之后，精核和卵核则竞相争夺这种原核形成物质。在小鼠和大鼠，精核比卵原核对原核形成物质具有更大的亲和力，因此，雄原核比雌原核大，但其他动物则不是这样。多精子进入卵母细胞后，同时竞争原核形成物质，使原核直径变小。原核直径和卵母细胞发育能力具有相关性，可以用来判定体外受精后胚胎质量及发育潜力。我们的结果表明：体外受精后两原核受精卵原核直径和成鼠相比虽然没有显著差异，但也略低于成鼠。PMSG处理显著提高了性成熟前后小鼠卵母细胞正常受精的比例，原核直径也有显著的提高，幼鼠受精卵原核直径达到了成年鼠水平。这些结果表明，多精受精是幼鼠卵母细胞发育能力差的一个因素。注射PMSG能够降低多精受精的发生，可能与促性腺激素能够延迟核成熟，使细胞质成熟充分有关。

卵母细胞在成熟过程中，皮质颗粒向皮质迁移，完成核成熟、到达MⅡ期时，CGs沿质膜下呈线状排列，（Cran等，1989；谭景和，1995）。外排的皮质颗粒内容物中含有蛋白酶或糖苷酶，可溶解透明带ZP₃（糖蛋白）而阻止多余精子与透明带相结合，避免多精受精的发生（谭景和，《脊椎动物比较胚胎学》）。皮质颗粒迁移不完全或提前发生胞吐，都会引起多精受精的发生。我们的实验结果表明：卵母细胞成熟后，幼鼠皮质颗粒迁移不完全比例显著高于成年鼠，这也是幼鼠卵母细胞体外受精后，多精受精比例高，发育能力低的原因。注射PMSG后，显著提高了皮质颗粒迁移完全的比例，幼鼠和成鼠没有差别，皮质颗粒提前胞吐的比例，在性成熟前后和PMSG处理前后都没有差别。

（三）性成熟及促性腺激素对小鼠卵母细胞胞质中GSH含量的影响

在观察多精受精时我们发现，幼鼠卵母细胞经体外受精后，精子去凝集形成原核的比例显著低于成年鼠，注射PMSG后显著提高了原核形成的比例。说明多个精子进入同时竞争雄原核形成物质，导致精核不能去凝集。精子细胞核的解聚需要精子细胞核中二硫键的还原来诱导。GSH提供启动雄原核形成之前染色质解凝聚所需的还原基团，另外，GSH还有抗氧化，维持减数分裂纺锤体形态，细胞膜稳定等作用。因此我们测定了性成熟前后小鼠卵母细胞内的GSH水平。结果表明，体外成熟后，幼鼠卵母细胞胞质中的GSH含量显著低于成年鼠，注射PMSG后显著提高了胞质中GSH的含量，幼鼠GSH含量达到成年鼠水平。这与Ulrike Luderer（2001）报道的注射PMSG后提高了大鼠卵巢中GSH含量的结果相一致。

谷胱甘肽的合成需要两种酶三种底物，两种酶分别是γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶，三种底物是胱氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺。细胞培养液中半胱氨酸迅速氧化成胱氨酸。进入细胞后，迅速被还原为半胱氨酸（Bannai and Tateishi，1986）。TCM199中的半胱氨酸含量很低（0.6μmol/L）且十分不稳定，易被氧化成为胱氨酸，这样就可能会使GSH合成受阻。TCM199中胱氨酸的含量相对较高（83.2μmol/L），有实验证明象半胱胺和β-巯基乙醇这样的低分子量的巯基物质能够通过还原胱氨酸为半胱氨酸，并促进细胞对半胱氨酸的利用来促进GSH合成。半胱胺能增加半胱氨酸吸收，现在已经证明牛（de Matos等，1995）、猪、水牛、山羊、绵羊（de Matos等，2002）和小鼠（de Matos等，2003）等在卵母细胞体外成熟过程中添加半胱胺能促进细胞内GSH合成，帮助入卵精子解聚和雄原核形成，进而提高胚胎发育水平。

我们向成熟培养液中添加半胱胺和胱氨酸（100μmol/L、200μmol/L）能显著提高性成熟前后卵母细胞的发育能力，这与本实验室之前报道的提高成年鼠卵母细胞发育能力的结论相一致。但性成熟前后小鼠卵母细胞发育能力还有差别，幼鼠卵母细胞发育能力还是比成鼠差。于是我们将浓度增加1倍，浓度分别为半胱胺200μmol/L和胱氨酸400μmol/L，这时卵母细胞发育能力没有继续得到改善，性成熟前后卵母细胞发育能力还是存在差别，我们检测了半胱胺和胱氨酸浓度分别为200μmol/L、400μmol/L时，卵母细胞胞质中的GSH含量，发现幼鼠显著低于成鼠（0.64μmol/L±2.3μmol/L和2.10μmol/L±0.3μmol/L），说明在底物充足的情况下，幼鼠卵母细胞合成GSH的能力显著低于成年鼠。这一结果与2003年Matos报道的结果相一致（Matos等，2003）。于是我们检测了GSH合成途径中酶的mRNA表达，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶包括催化亚基（GCLC）和调节亚基（GCLM），是谷胱甘肽合成途径中的限速酶，分别由不同的mRNA编码，催化亚基催化半胱氨酸和谷氨酸结合形成γ-谷氨酰半胱氨酸，调节亚基没有催化活性，但能与催化亚基结合，调节催化亚基的催化效率，调节反应速度。有报道表明，添加BSO（抑制GCL活性）能显著降低谷胱甘肽的合成，增加了颗粒细胞凋亡和卵母细胞碎裂。在卵巢中健康卵泡Gclm表达水平高，而闭锁卵泡GCLM表达量低，排卵前促性腺激素刺激使得膜细胞GCLM显著增加，促性腺素处理后GCLC和GCLM水平增加，GCL酶活性增加，使得卵巢GSH合成显著增加（Luderer U等，2001）。我们的结果表明，幼鼠卵母细胞中GCLC和GCLM mRNA水平显著低于成鼠（T-test），谷胱甘肽合成酶表达两者之间没有差别，但也略低于成鼠。注射PMSG显著提高了这三种酶的表达。

（四）性成熟前后小鼠卵泡和卵母细胞发育同步化程度

卵母细胞发育能力是随着卵泡和卵母细胞生长发育逐渐获得的。在这一过程中，卵母细胞存储RNA和蛋白质，细胞核发生GVBD，染色质凝集，第一极体排出，以及M-Ⅱ抑制，卵胞质发生细胞器重排，MAPK和MPF活性变化，Ca²⁺释放机制等变化。卵泡直径和卵母细胞直径是衡量卵母细胞质量的一个指标，大卵泡获得的卵母细胞发育能力显著高于小卵泡，（Furher F，1989），卵母细胞直径越大，发育能力越强。有报道表明，22天和26天小鼠卵母细胞发育能力有显著差异，取相同大小的22天和26天小鼠卵母细胞体外受精后，26天小鼠卵母细胞发育能力显著高于22天，这说明卵母细胞获得发育能力是与卵泡发育有关的。26天小鼠卵母细胞随着直径的增加发育能力增加（Eppig等，1992）。卵泡和卵母细胞发育同步化，反映颗粒细胞增殖程度和卵母细胞生长同步化程度和能否用卵泡大小判断卵母细胞发育能力。以前的报道表明猪和绵羊性成熟后卵泡细胞和卵母细胞发育才同步化，性成熟前羊卵母细胞和卵泡发育同步化没有成年羊好（0.11 Vs 0.61）。我们在小鼠上的研究表明，性成熟前小鼠卵泡和卵母细胞发育同步化程度与成鼠相差不多（0.45 Vs0.56）。而且，我们用于做发育实验的卵母细胞都是来自于大于300μm的卵泡，这部分卵泡所取得卵母细胞直径在性成熟前后也没有差别（性成熟前卵子直径：77.78μm Vs 成年：77.06μm）。由此，我们得到结论，幼鼠卵母细胞发育能力差，不是因为幼鼠卵母细胞直径小及卵丘细胞数量少导致的。

五、结论

①幼鼠卵母细胞发育能力比成年鼠差，去除卵丘细胞对卵母细胞发育能力的影响，裸卵卵母细胞发育能力在性成熟前后也有差别，4周小鼠卵母细胞发育能力接近于成年鼠水平，注射PMSG后显著提高了性成熟前后卵母细胞发育能力，幼鼠卵母细胞发育能力达到了成年鼠水平。

②体外受精后，性成熟前后小鼠卵母细胞精子穿透率没有差别，多精受精率幼鼠显著高于成年鼠，而且幼鼠的多精受精没有形成原核的比例显著高于成年鼠。正常受精的受精卵，雌雄原核直径平均值，性成熟前后卵母细胞没有差别。促性腺激素能提高性成熟前后卵母细胞正常受精的比例，雄原核形成比例，以及正常受精受精卵的原核直径。

③体外成熟后，幼鼠卵母细胞皮质颗粒迁移不完全比例显著高于成年鼠，4周小鼠与3周小鼠没有差别，和6～8周小鼠也没有差别。注射PMSG后，显著提高了皮质颗粒迁移完全的比例，3周和6～8周小鼠卵母细胞没有显著差异，提前胞吐的比例在性成熟前后及注射PMSG前后都没有差别。

④体外成熟后，性成熟前后卵母细胞胞质中GSH水平，幼鼠显著低于成年鼠，注射PMSG后，显著提高了性成熟前后卵母细胞GSH水平，幼鼠达到了成年鼠水平。

⑤成熟培养液中添加胱氨酸（100μmol/L）和半胱胺（200μmol/L）能提高性成熟前后卵母细胞发育能力，增加浓度（200μmol/L、400μmol/L）没有继续改善卵母细胞发育能力，向PMSG处理组卵母细胞的成熟培养液中添加胱氨酸（200μmol/L）、半胱胺（400μmol/L）显著提高了卵母细胞发育能力，成鼠显著高于幼鼠卵母细胞的囊胚发育率。

⑥GSH合成途径中的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的两个亚基，催化亚基（GCLC）和调节亚基（GCLM）在性成熟前后有显著差别，谷胱甘肽合成酶表达两者之间没有差别，但也略低于成鼠。注射PMSG显著提高了这三种酶的表达。

⑦卵泡和卵母细胞直径以及发育同步化程度不是性成熟前小鼠卵母细胞发育能力差的因素。

⑧小鼠体外成熟卵母细胞SrCl₂最佳激活浓度为20mmol/L，这一浓度的孤雌激活率和囊胚发育率最高。

（曹新燕）